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纤溶酶原饼环区5蛋白重组大肠杆菌高效表达体系的建立
目的建立纤溶酶原饼环区5(Human plasminogen kringle 5,hPK-5)蛋白重组大肠杆菌高效表达体系,为高密度发酵创造条件.方法观察一级、二级种子的生长状态,比较表达hPK-5蛋白的4种重组工程菌株在相同条件下的表达情况,选出首选发酵种子;对其培养时间、诱导时间、培养基种类、pH等条件进行优化;并用凝胶成像分析系统对SDS-PAGE结果进行分析.结果经过筛选,JM109/pBV220/hPK-5(简称JP5)是获取hPK-5蛋白的首选工程菌株,其佳表达条件是LB培养基(pH7.4、溶解氧充足)、30℃培养3h、42℃诱导6 h.在此条件下,JP5表达目的蛋白占菌体总蛋白的38%左右.结论为高密度发酵获取hPK-5蛋白奠定了实验基础.
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毕赤酵母表达重组hPK-5蛋白不均一性的鉴定
对毕赤酵母表达重组人纤溶酶原Kringle 5(hPK-5)蛋白的不均一性进行了鉴定.应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法及分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯度分析.采用糖蛋白染色法鉴定是否为糖蛋白.以Edman降解法测定N端氰基酸,采用高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)联用技术测定蛋白质精确分子质量.结果表明:SDS-PAGE测定为单一条带,纯度大于95%,SEC-HPLC测定为单一色谱峰,纯度大于95%,RP-HPLC测定为几个紧密相连的峰.糖蛋白染色为阴性.N端氨基酸测定结果表明含多个N端氨基酸.液质联用测定精确分子质量的结果表明hPK-5蛋白是相对分子质量分别为10 744.88,10 646.00,10 533.00和10 419.63的混合物.以上结果准确鉴定出毕赤酵母表达的该重组hPK-5蛋白是C端完整而N端依次缺失0～3个氨基酸的不均一蛋白.
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重组hPK-5质粒DNA基因治疗制剂的质量标准研究
目的:建立重组hPK-5质粒DNA基因治疗制剂的质量标准和检测方法.方法:采用限制性酶切图谱分析鉴定质粒DNA结构和PCR法鉴定插入的hPK-5基因作鉴别试验;采用分光光度法测定质粒DNA含量和A260/A280比值;采用琼脂糖凝胶电泳法分析质粒DNA的超螺旋构象比例和残留RNA含量;采用阴离子交换色谱法分析HPLC纯度;采用ELISA法测定hPK-5蛋白的表达量;采用内皮细胞迁移法测定hPK-5蛋白的生物学活性.结果:重组质粒DNA的限制性酶切片段大小与理论值一致;插入基因PCR扩增片段大小与理论值相符;质粒DNA含量为1.12 mg·mL-1;A260/A280比值为1.83;琼脂糖凝胶电泳法测定超螺旋构象质粒的比例为95.4%;HPLC测定超螺旋质粒DNA占93.8%,开环质粒DNA占6.2%,琼脂糖凝胶电泳法测定未检出 RNA残留;没有检出其他杂质;以2μg重组hPK-5质粒转染5×105 Hela细胞48 h后,2 mL培养上清中hPK-5蛋白浓度为109 ng·mL-1;以培养上清进行内皮细胞迁移试验,转染重组hPK-5质粒DNA组迁移的内皮细胞数明显少于对照组(P＜0.05).其他项目均符合相应的规定.结论:建立了重组hPK-5质粒DNA基凶治疗制剂的检定方法及其质量标准,为有效控制该类产品的质量打卜基础.
