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重组F基因缺失型仙台病毒hFGF2基因治疗制剂质控方法及质量标准的建立
目的 建立搭载2型人成纤维细胞生长因子(human fibroblast growth factor 2,hFGF2)重组F基因缺失型仙台病毒(Sendai virus,SeV)制剂(SeV-hFGF2/dF)的质控方法与质量标准.方法 采用RT-PCR法对SeV载体中插入的目的基因hFGF2和缺失的F基因进行鉴别,同时扩增两个基因片段M-HN和hFGF2-NP,以鉴别该病毒;鸡红细胞凝集试验检测制品的血凝效价,并计算病毒颗粒数;免疫荧光法测定SeV-hFGF2/dF的感染滴度,结合病毒颗粒数计算其比滴度;SeV-hFGF2/dF体外感染COS7细胞后,ELISA法测定感染上清中hFGF2的表达量;将感染上清体外作用于BALB/c 3T3细胞,3T3细胞增殖法检测hFGF2的生物学活性;酚-氯仿法抽提样品的DNA,Pico-Green法测定制品中DNA残留量;PCR法检测腺病毒残留.结果 重组SeV-hFGF2/dF基因组中hFGF2基因、F基因、M-HN片段和hFGF2-NP片段的RT-PCR鉴定结果与理论值相符;血凝效价为1∶512,病毒颗粒数为4.12× 1010VP/ml;感染滴度为2.06×109 CIU/ml,比滴度为5.0％;SeV-hFGF2/dF以MOI 10感染COS7细胞72 h后,ELISA检测上清中hFGF2的表达量为117.1 ng/ml;表达上清中hFGF2的生物学活性为437 IU/ml;DNA残留量为2.24 ng/ml;制品中腺病毒的PCR检测结果为阴性;其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及《中国药典》三部(2010版)要求.结论 初步建立了SeV-hFGF2/dF的质控方法和质量标准,为保证该制品的安全、有效、质量可控奠定了基础,同时也为其他SeV载体基因治疗药物的质量控制提供了参考.
关键词： 重组F基因缺失型仙台病毒 2型人成纤维细胞生长因子 基因治疗 质量控制
