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CRISPR/ Cas9文献资料
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Pklr基因敲除小鼠的构建及其糖脂代谢研究
目的 丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)作为糖酵解途径的关键限速酶之一,主要在肝脏和红细胞中表达,在糖脂代谢过程中发挥着重要作用.对于PK的研究目前主要集中在细胞实验与临床观察水平,动物模型的缺乏限制了对其进一步研究.因此该研究目的在于建立Pklr基因缺陷小鼠模型,并探索该酶在机体中与糖脂代谢的关系.方法 本研究利用CRISPR/Cas9系统,设计引物sgRNA1与sgRNA2,分别靶向LPK外显子1和共用外显子3.通过测序、实时定量PCR、Western印迹及PK活性测定试剂盒检测小鼠Pklr基因在转录、蛋白质和酶活性等不同层面上的变化,之后通过正常与高脂饮食,检测小鼠体重、白色脂肪及脾脏变化验证PK与糖脂代谢的关系.结果 经过检测发现,小鼠Pklr基因双位点发生基因编辑,与野生型小鼠相比,转录水平下降至24％,LPK蛋白几乎不表达,酶活性下降至33％,在基因、转录、蛋白质和酶活性不同层面上证明成功获得了Pklr基因缺陷小鼠模型,并且发现该基因突变纯合子小鼠在高脂饮食条件下显示出体重下降和白色脂肪积累(P值分别为0.0040、0.0200),同时两种饮食条件下脾脏重量都显著上升(P =0.0003).结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了Pklr基因缺陷小鼠,并且该基因缺陷会导致异常的糖脂代谢.Pklr基因敲除小鼠模型为进一步探索PK在机体内调控机制与糖脂代谢的关系提供了平台.
关键词： CRISPR/ Cas9 Pklr 基因缺陷 炎症反应 糖脂代谢
