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SiteFinding PCR文献资料
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利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因
目的:新型琼胶酶基因的筛选.方法:根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树.利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析.将目的基因插入pET 24a(+)载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3),利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活.结果:获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas sp.LD5.获得了一个新的基因,命名为agaD.agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa.序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89％和77％.重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 U·ml-1,说明该蛋白为琼胶酶.结论:采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具.
