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SYBR Green 1荧光定量文献资料
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随机扩增多态性技术联合荧光定量高敏检测三种疱疹病毒方法的建立
目的:建立一种随机扩增多态性技术(RAPD)联合荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)高敏定量检测单纯疱疹病毒(HSV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)的新方法.方法:根据文献筛选出数十条随机引物,分别对三种疱疹病毒进行随机扩增,产物经2％琼脂糖凝胶电泳,选取稳定清晰条带进行分离、纯化及克隆测序,应用blast-nr比对genebank现有病毒序列,选取高于99％匹配度的基因序列作为目的片段,并在其内部用primer3.0设计特异性内引物.经过引物筛选及条件优化后建立RAPD联合qPCR检测新方法,分别检测三种疱疹病毒.结果:经过筛选,确定了HSV、HCMV、VZV扩增灵敏性及特异性好一组引物,建立的RAPD-qPCR可分别检测出1∶106 HSV、1∶105 HCMV和1∶105 VZVDNA,而单一 qPCR仅能检测1∶103 HSV、1∶102HCMV和1∶103 VZVDNA.RAPD-qPCR相比于单一qPCR灵敏性提高100-1000倍,RAPD-qPCR扩增大于1∶105病毒DNA得到的CT值均小于22.96±0.81,与102 copies/μL的标准线相距远,易于区分阴性和阳性.此外,用乙型肝炎病毒及疱疹病毒互为对照未见非特异扩增,特异性好.结论:随机扩增多态性技术联合荧光定量是一种检测三种病毒高度灵敏及特异的检测方法.
