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AdEasy腺病毒文献资料
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脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备
目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒.方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMDl8-T载体中,酶切测序.回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中.筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度.结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMDl8-T载体得到1400 bp左右的片段.重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段.PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段.转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段.取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,后所得病毒滴度为2.5x 10<'9>pfu/ml.结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础.
