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Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究
目的 用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18 (ROP18)的293T细胞株. 方法 PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体pLVCT-tTR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体pLVCT-tTR-KRAB-ROP18.经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒psPAX2(4μg)和pMD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光.于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞.以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况.结果 PCR扩增rop 18片段为960 bp,与预期大小一致.经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功.转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光.经DOX诱导24h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光.RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致. 结论 采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株.
关键词： 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 慢病毒 四环素诱导调控表达系统 -
用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株
目的 构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株. 方法 从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达.在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting 检测带有Ty标签的FABZ表达情况. 结果 筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ.FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P＜0.05). 结论 构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株.
关键词： 刚地弓形虫 脂肪酸代谢酶 四环素诱导调控表达系统 缺陷株
