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刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建刚地弓形虫棒状体蛋白10 (ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白. 方法 设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18.经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP 18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况. 结果 成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确.分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-R()P18组可同时扩增出1 761 bp(ROP10基因)和1 665 bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXD-ROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761 bp和1 665 bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXD-ROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白. 结论 成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白.
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刚地弓形虫RH株ROP18基因真核表达载体的构建
目的 PCR扩增刚地弓形虫(Toxplasma gondii)棒状体蛋白18 (ROP18)基因,构建真核表达载体pVAX1-ROP18,并检验其在真核细胞中的表达.方法 ROP18基因和质粒pVAX1分别经HindⅢ和BamH I双酶切,在T4连接酶作用下连接过夜,将连接产物转化至大肠埃希菌E.coil XL1-Blue感受态细胞,经菌落PCR、双酶切及测序正确的重组质粒pVAX1-ROP18转染至HeLa细胞内.试验设空白对照组和pVAX1空质粒对照.提取各组HeLa细胞的总RNA并将其逆转录成cDNA,分别进行管家基因β-actin和ROP18基因的RT-PCR扩增;采用Western blot法检测转染后各组细胞ROP18蛋白的表达情况.结果 经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测,ROP18基因的RT-PCR扩增片段大小为1665bp,与预期值相符;ROP18基因重组质粒转化菌菌落PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定,大小为1665bp,与预期值相符;双酶切重组质粒得到预期酶切片段;重组质粒的目的基因序列与弓形虫RH株ROP18基因(登录号AM075204.1)序列比对完全一致.脂质体转染后各组β-actin的RT-PCR扩增目的片段均为613bp,与预期值相符;pVAX1-ROP18重组质粒转染组的ROP18的RT-PCR扩增目的片段大小为1665bp,而其他组无该目的基因条带.Western blot检测重组质粒pVAX1-ROP18能够在HeLa细胞内表达ROP18蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pVAX1-ROP18,且该重组质粒能够在真核细胞内表达ROP18蛋白.
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刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建
目的 构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18 (TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况. 方法 重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先后克隆至双启动子真核表达载体质粒pVAXD的多克隆位点中,构建pVAXD-ROP16-ROP18重组质粒.分别用双酶切和PCR验证正确的重组质粒及对照组质粒转染Hela细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板进行ROP16基因、ROP18基因与管家基因β肌动蛋白基因的RT-PCR扩增,采用间接免疫荧光法检测各自基因的表达. 结果 重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18经PCR及双酶切鉴定构建正确.转染后经RT-PCR检测,实验组与对照组β肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组ROP16基因、ROP18基因扩增产物分别为1 700 bp和2 100 bp,与预期大小相符,而对照组均未扩增出ROP16及ROP18基因.间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光. 结论 成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,该质粒可在真核细胞中表达.
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刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建
目的 构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18 (ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况. 方法 重组质粒pVAX 1-ROP18和pVAX1-ROP12分别经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至pVAX1-ROP18重组质粒.经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒pVAX 1-ROP18-ROP12转染至HeLa细胞.同时设空质粒组、pVAX1-ROP18转染组和pVAX1-ROP12转染组.提取各组HeLa细胞的总RNA并逆转录为cDNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12瞬时转染HeLa细胞后蛋白的表达情况. 结果重组质粒pVAX 1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符.提取重组质粒经HindⅢ、BamH Ⅰ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确.测序结果显示,pVAX 1-ROP18-ROP 12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100％,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99％.脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符.pVAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带.间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光.Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000. 结论构建了重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达.
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Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究
目的 用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18 (ROP18)的293T细胞株. 方法 PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体pLVCT-tTR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体pLVCT-tTR-KRAB-ROP18.经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒psPAX2(4μg)和pMD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光.于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞.以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况.结果 PCR扩增rop 18片段为960 bp,与预期大小一致.经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功.转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光.经DOX诱导24h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光.RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致. 结论 采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株.
关键词： 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 慢病毒 四环素诱导调控表达系统 -
弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及鉴定
目的:原核表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs) 18,建立检测和定位虫体ROP18蛋白的方法.方法:运用PCR技术扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因,克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中诱导表达,经KC1染色切胶纯化重组ROP18蛋白,并制备其兔多克隆抗体.采用蛋白质印迹技术和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测和定位ROP18在弓形虫速殖子体内的表达.结果:成功表达重组ROP18蛋白,并获得其多克隆抗体.经蛋白质印迹技术检测出虫体ROP18特异性条带,IFA技术检测出ROP18分布于虫体棒状体.结论:通过制备多克隆抗体,利用蛋白质印迹技术和IFA技术能检测和定位ROP18蛋白在弓形虫体内表达.
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弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响
目的 构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响.方法 将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定.以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况.转染48 h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24 h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平.结果 重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达.转染48 h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P＜0.05);转染24 h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P＜0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P＜0.05).结论 成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡.
关键词： 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 神经干细胞C17.2 重组腺病毒 细胞凋亡 -
弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析
目的 克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析.方法 提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3).IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测.结果 PCR得到约1 665 bp目的 基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60 kD的位置出现目的 蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83 kD的位置出现目的 蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础.
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弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定
目的 构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定.方法 采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1 -ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞(HFF)进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定.结果 经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确；经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定,AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达.结论 成功构建pBudCFA.1 -AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达.
