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转染过氧化氢酶-过氧化物酶基因对Aβ诱发PC12细胞凋亡的保护作用
目的观察转染过氧化氢酶-过氧化物酶(CPX)基因对神经毒物质β淀粉样肽(Aβ)诱发细胞凋亡的保护作用.方法转染并筛选稳定高表达CPX基因的PC12细胞系,用神经毒物质Aβ处理细胞,观察其抗逆变致凋亡的能力.通过电镜、DNA片段化的测定、MTT比色微量分析及流式细胞凋亡率分析观察转基因后对Aβ诱发细胞凋亡的保护作用.结果加入神经毒物质Aβ后,未转染CPX基因的PC12细胞出现凋亡的特征性形态学改变,电泳可见断裂的DNA片段,流式细胞仪检测细胞凋亡率较CPX基因转染组明显增加.MTT比色微量分析显示细胞活力下降(P＜0.001).结论Aβ诱导的神经细胞凋亡与活性氧的产生有关,转染CPX基因能对抗Aβ的神经毒性,保护Aβ所致的神经细胞凋亡.
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神经细胞黏附因子L1结构与功能的关系
目的获得重组神经细胞黏附因子L1(L1),研究其结构与功能的关系.方法通过RT-PCR方法,扩增出L1cDNA;构建原核表达pET 28 α+和真核表达pcDNA3.0载体;并构建L1胞外域不同结构基序的原核表达载体;将pETL1s转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BLL1s;将pcDNA3.0-L1真核表达质粒转染入PC12细胞中,筛选稳定表达L1的基因工程细胞株PC12-L;用原核表达的L1胞外不同结构域蛋白刺激PC12_L1基因工程细胞,观察其分化情况.结果IgI-FN5胞外域、Ig(Ⅰ-Ⅵ)免疫球蛋白样结构域和FN(1-5)纤连蛋白型Ⅲ重复序列均可明显促进PC12-L1细胞突起生长,具有生物学活性;Ig(Ⅴ-Ⅵ)也可促进PC12-L1细胞突起生长,但生物活性显著降低;FN(3-5)不能促进PC12-L1细胞突起生长,没有生物活性.结论L1分子胞外至少有2个结构域Ig(Ⅰ-Ⅵ)和FN(1-5)可显著促进PC12-L1细胞的突起生长,对L1分子生物活性的维持必不可少;胞外免疫球蛋白结构域Ig(Ⅴ-Ⅵ)对维持L1分子的生物活性不十分重要;纤连蛋白型Ⅲ重复序列结构域FN(3-5)对维持L1分子的生物活性不重要.
关键词： 神经细胞黏附因子L1 基因表达 细胞转染 PC12细胞 -
人MCHR2基因shRNA真核表达载体体外转染
目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率.结果 与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上.
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MCF-7细胞瞬时基因表达转染模式的建立
目的建立一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达细胞转染模式. 方法选择人乳腺癌细胞系MCF-7,采用Polyethylenimine(PEI)作为转染剂,对细胞密度、载体DNA量、PEI氮与DNA磷的比率(PEI-N:DNA-P)以及PEI-DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间等对转染效率的影响进行了比较分析.结果转染时的24孔板每孔接种的细胞以2×105为宜,PEI-N:DNA-P的优比率不是固定的,它与转染时DNA的量有关,每孔转染1μgDNA时其优PEI-N:DNA-P比率为33:1左右,而每孔转染4μg DNA时其优PEI-N:DNA-P比率为9:1左右.另外,PEI-DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间至少需要3 h,佳时间为5～7 h.结论利用转染剂PEI,控制合适的细胞密度、DNA质量、PEI-N:DNA-P比率和无血清培养的时间,可成为一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达的细胞转染模式.
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小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK293T细胞凋亡和自噬的影响
目的 检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义.方法 分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2 (a) purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化.结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741 ±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012.结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬.
关键词： 精子发生相关蛋白3基因 HEK 293T细胞 细胞转染 自噬 免疫印迹法 小鼠 -
阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析
本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料.预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455～+55 bp)、pGL3-417(-417～+55 bp)、pGL3-280(-280～+55 bp)、pGL3-202(-202～+55 bp)、pGt3-81(-81～+55 bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL347(-47～+55 bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47～+55 bp区无启动子活性.绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81～+55 bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47～+55 bp)和空载体pEGFP-1未见表达.因此-81～-47 bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列.
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多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达
本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1(两串联)基因(mucl-2vntr)的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础.以MUC1-2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和Xba Ⅰ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3.1/myc-his B载体中,转化E coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3.1-2vntr/myc-his B重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重组体在细胞内外的表达.结果表明:合成的MUC1-2VNTR基因全长约140 bp,所构建的pcDNA3.1-2vntr/myc-his B重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因.将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达.结论:成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3.1-2vntr/myc-his B,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础.
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雄激素调节卵巢癌细胞IL-6基因启动子活性的研究
目的 探讨雄激素诱导卵巢癌细胞IL-6基因启动子活化的分子机制.方法 选择SKOV-3细胞作为研究模型,应用ELISA、RT-PCR及荧光素酶检测技术观察5α-二氢睾酮(5α-dihydrotestosterone,DHT)对IL-6表达水平及IL-6基因启动子活性的影响,并对DHT诱导IL-6基因启动子活化的机制进行研究.结果 (1)DHT可促进SKOV-3细胞IL-6分泌及相应mRNA的表达,该作用可被雄激素受体(AR)阻断剂氟他胺(flutamide,Flu)完全阻断,提示DHT诱导上述作用是AR途径介导的.(2)IL-6本身能以剂量依赖性的方式增强SKOV-3细胞IL-6基因启动子的转录活性,DHT也具有与IL-6相似的作用.DHT的这种作用可被Flu完全阻断,也可被抗IL-6中和抗体部分阻断.(3)转录因子NF-IL-6、NF-κB及其亚单位p50、p65均可诱导SKOV-3细胞IL-6基因启动子的活性.DHT不改变NF-IL-6介导的IL-6基因启动子的转录活化,而增强NF-κB(p50+p65)及其亚单位p50、p65介导的IL-6基因启动子的转录活化.结论 雄激素增强的IL-6基因启动子转录活性是AR途径介导的,同时有部分是通过IL-6的作用而实现.雄激素很可能通过AR与转录因子NF-κB或其亚单位P50和p65之间蛋白-蛋白的相互作用反式激活IL-6基因启动子的活性.
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猪戊肝病毒的克隆和部分序列分析
目的 研究乙肝病毒“a”决定簇129Leu变异株免疫原性低下的机理及其临床意义。 方法 用野毒株质粒DNA（p3.8Ⅱ）及用p3.8Ⅱ组建的129Leu、129His、145Arg（分别称为p3.8Ⅱ 129L、p3.8Ⅱ 129H 、p3.8Ⅱ 145R）重组质粒DNA转染HepG2细胞，检测转染细胞上清HBsAg、HBeAg水平及胞内HBV复制情况。以重组质粒DNA免疫BALB/c及C57BL/6鼠，比较各重组质粒DNA免疫鼠后诱生的抗体水平及脾细胞特异性IFN-γ水平。对各重组质粒DNA表达S基因“a“决定簇作亲/疏水性分析。在134例HBsAg阳性慢性乙肝患者中用PCR-SSCP筛选后测序方法，寻找“a”决定簇变异株。 结果p3.8Ⅱ 129L重组质粒免疫鼠血清的抗-HBs效价与脾细胞诱生的IFN-γ在2种品系鼠中均低于野毒型或p3.8Ⅱ 129H免疫鼠（P＜0.05）。在134名HBsAg阳性的慢性乙肝患者血清中，仅有9/134（6.9%）出现“a”决定簇氨基酸变异，但其中1例为129Leu变异。 结论 129Leu变异株的T、B细胞免疫原性低下主要是由于该氨基酸变为亮氨酸所致，可能与该位点变为亮氨酸后疏水性增高有关。该变异株检出率虽然不高，但确实存在于慢性乙肝患者中。
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乙肝病毒"a"决定簇129Leu变异株免疫原性低下的机理及临床意义
目的研究乙肝病毒"a"决定簇129Leu变异株免疫原性低下的机理及其临床意义. 方法用野毒株质粒DNA(p3.8Ⅱ)及用p3.8Ⅱ组建的129Leu、129His、145Arg(分别称为p3.8Ⅱ 129L、p3.8Ⅱ 129H 、p3.8Ⅱ 145R)重组质粒DNA转染HepG2细胞,检测转染细胞上清HBsAg、HBeAg水平及胞内HBV复制情况.以重组质粒DNA免疫BALB/c及C57BL/6鼠,比较各重组质粒DNA免疫鼠后诱生的抗体水平及脾细胞特异性IFN-γ水平.对各重组质粒DNA表达S基因"a"决定簇作亲/疏水性分析.在134例HBsAg阳性慢性乙肝患者中用PCR-SSCP筛选后测序方法,寻找"a"决定簇变异株. 结果p3.8Ⅱ 129L重组质粒免疫鼠血清的抗-HBs效价与脾细胞诱生的IFN-γ在2种品系鼠中均低于野毒型或p3.8Ⅱ 129H免疫鼠(P＜0.05).在134名HBsAg阳性的慢性乙肝患者血清中,仅有9/134(6.9%)出现"a"决定簇氨基酸变异,但其中1例为129Leu变异. 结论 129Leu变异株的T、B细胞免疫原性低下主要是由于该氨基酸变为亮氨酸所致,可能与该位点变为亮氨酸后疏水性增高有关.该变异株检出率虽然不高,但确实存在于慢性乙肝患者中.
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超声微泡造影剂联合survivin反义寡核苷酸对CHG-5细胞的阻断作用
目的 探讨超声微泡造影剂联合survivin反义寡核苷酸对人胶质瘤细胞系CHG-5的阻断作用.方法 针对survivin基因序列设计合成survivin反义寡核苷酸,将实验分为4组.A组:survivin反义寡核苷酸(ASOND)并超声微泡造影剂联合超声照射;B组:survivin反义寡核苷酸(ASOND)并脂质体转染联合超声照射;C组:survivin反义寡核苷酸(ASOND)并脂质体转染;D组:空白对照组.利用免疫细胞化学及Western blotting检测survivin蛋白的表达变化,MTT法检测细胞增殖的变化.结果 采用超声微泡造影剂联合超声照射介导的survivin反义寡核苷酸基因组,CHG-5细胞中survivin蛋白表达无论是免疫组化检测结果还是Western blotting检测结果都较其他组明显降低(P＜0.05),CHG-5细胞生长率也明显受到抑制(P＜0.05).结论 超声微泡造影剂介导的survivin反义寡核苷酸转染是一种无创、新型、高效的基因转染方法.
关键词： Survivin基因 反义寡核苷酸 造影剂 超声微泡 细胞转染 -
T-STAR基因对结肠癌细胞系HCT-116端粒酶活性的影响
目的:通过正、反义T-STAR(testis-signal transduction and activator ofRNA)基因转染结肠癌HCT-116细胞,观察对细胞端粒酶活性的影响.方法:用脂质体Lipofectamine法将正、反义T-STAR基因转染入HCT-116细胞,用RT-PCR及Westernblot方法检测该细胞T-STAR基因mRNA和蛋白表达变化,并用PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性改变.结果:在T-STAR转染的结肠癌HCT-116细胞中,TSTAR mRNA和蛋白表达显著增加(分别为296%,180%,P＜0.01),端粒酶活性明显升高;而在反义TSTAR转染的细胞中,T-STAR mRNA和蛋白表达显著下降(分别为59%,83.8%,P＜0.01),端粒酶活性明显降低.转染空白载体和未转染细胞中T-STAR表达极端粒酶活性无显著性差异.结论:结肠癌HCT-116细胞T-STAR基因可能参与细胞端粒酶活性的正相调节.
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细胞周期蛋白D1 RT-PCR ELISA的建立及其初步应用
目的:建立一种灵敏、特异和简便实用的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA表达水平的检测手段.方法:生物素标记Cyclin D1 5'端引物,PCR DIG Labeling Mix取代dNTP,RT-PCR终产物置于链霉亲和素包被的ELISA板中孵育,洗涤、显色后,自动酶联检测仪测A45onm值.常规RT-PCR方法作对照.检测对象包括Cyclin D1表达细胞系SGC7901,转染反义Cyclin D1基因的SGC7901D1AS细胞及转染空载体的SGC7901neo细胞,原发性胃癌组织30例、胃癌旁和正常胃黏膜组织20例,胃良性病变组织22例.结果:RT-PCR ELISA与RT-PCR琼脂糖电泳检测结果吻合,所测得的A450nm值与Cyclin D1特异性基因片段的丰度和检测细胞数量有一很好的对应关系.SGC7901胃癌细胞转染Cyclin D1反义基因后,Cyclin D1mRNA表达显著降低(P＜0.05).Cyclin D1 mRNA在胃良性疾病起即开始明显升高(P＜0.05).在胃癌各组中,进展期胃癌伴转移组的Cyclin D1 mRNA表达水平显著高于其他两组(P＜0.05).结论:本文建立的Cyclin D1 RT-PCR ELISA可作为一种侯选的、较为简便和半定量的cyclin D1 mRNA检测方法.致谢:第三军医大学数学教研室罗明奎主任在本课题结果统计分析的工作中给予了无私的指导和帮助.
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
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腺病毒增强转铁蛋白受体介导的针对突变型P53的大酶转染可促进肝癌细胞凋亡
目的:通过腺病毒增强的转铁蛋白受体介导法(AVET)将针对突变型p53(mtp53)的大酶(Maxizyme)基因转入肝癌细胞后篌对肝癌细胞凋亡的影响,探索AVET用于肝癌基因治疗的可行性,为肝癌的基因治疗探索一条新途径.方法:以带有mtp53基因的人肝癌细胞株MHCC97细胞为模型,用腺病毒增强转铁蛋白受体介导法将针对mtp53的pEGFP-Maxizyme基因和空载体pEGFP分别导入MHCC97细胞,荧光显微镜观察细胞转染情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mtp53 mRNA表达水平的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测转染后对细胞凋亡的影响.结果:转染后48h荧光显微镜下可见呈细胞形态的绿色荧光.收集细胞检测,实验组mtp53 mRNA表达水平与空载体组和空白对照组相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达水平下降(P＜0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡梯带(DNA Ladder);流式细胞仪分析显示细胞凋亡水平增高,凋亡指数22.95%,显著高于对照组的2.37%(P＜0.05).结论:腺病毒增强转铁蛋白受体介导的基因转移系统可将pEGFP-Maxizyme有效的转染到肝癌细胞株MHCC97中,Maxizyme在细胞内成功的切割了mtp53 mRNA,促进了肝癌细胞的凋亡,这为腺病毒增强转铁蛋白受体介导法在肝癌基因治疗中的应用提供了实验依据,也为肝癌的基因治疗提供了一条新途径.
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TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响
目的:TGIF(TGinteractingfactor)是TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制分子,且MAPK通路的活化能延长其半衰期,但他在肿瘤发生中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响.方法:将TGIF反义寡核酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测转染效率,MTT法检测胃癌细胞的增生速度,流式细胞术分析转染细胞的细胞周期和凋亡率的变化.结果:SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后,细胞增生受到部分抑制,72h后,他的抑制率达20.4%,但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变.TGF-β1处理后,与突变寡核苷酸转染组细胞和未转染组细胞相比,TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制(30%),G1期细胞含量增加更明显.结论:TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用,多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1,这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF,抑制TGF-β对自身的生长抑制作用,从而促进肿瘤的发生、发展与转移.
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三种不同方法转染THP-1巨噬细胞效果比较
目的 探讨通过腺病毒,慢病毒,脂质体2000三种方法转染THP-1巨噬细胞的佳方法.方法 采用腺病毒,慢病毒,脂质体2000三种方法分别转染THP-1巨噬细胞,并用荧光显微镜观察细胞转染荧光表达情况,流式细胞仪检测THP-1细胞转染效率,台盼蓝染色检测细胞病死率.结果 腺病毒对THP-1巨噬细胞转染效率可在对细胞损伤较小的情况下达较高水平,但可能对细胞免疫状态影响大.MOI=200时,转染效率较低,仅为(29.81 ±2.50)％,细胞病死率为(5.17±0.44)％;MOI=800,转染效率高,EGFP阳性率可达(86.49 ±6.11)％,细胞病死率为(8.80±0.54)％;MOI升至1200后,EGFP阳性率为(77.88±5.77)％,细胞病死率上升明显(14.50±0.77)％(P＜0.05);慢病毒转染效率高及细胞毒性较腺病毒低,但因其病毒产量低,实验消耗病毒量大,因而影响其应用.当MOI=10时,EGFP阳性率仅为(28.09±1.67)％,细胞病死率为(4.74±0.31)％;MOI=60时,转染率高,EGFP阳性率为(91.96±1.66)％,细胞病死率升至(7.25±0.50)％,此时病死率才有统计学意义(P＜0.05).脂质体2000对THP-1巨噬细胞毒性较大,细胞死亡率高,转染效率极低,不适合转染.结论 腺病毒与慢病毒转染THP-1巨噬细胞各存在一定优劣,在实验中需酌情选择,脂质体2000不适宜转染THP-1巨噬细胞.
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重组诱导型一氧化氮合酶在V79细胞中的表达及其对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的探讨成纤维细胞基因转染后产生的一氧化氮对血管平滑肌细胞增殖的影响.方法将诱导型一氧化氮合酶基因通过真核表达载体转入V79成纤维细胞中,用Griess法测定转染细胞生成的一氧化氮的量.将含有一氧化氮的细胞转染上清液加到培养的血管平滑肌细胞中,观察对平滑肌细胞生长状态的影响,用流式细胞仪分析细胞周期的变化.
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脂肪组织来源干细胞的成骨诱导和外源性基因转染表达研究
目的:探讨脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)表达外源性基因的可能性.方法:取小香猪腹部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等方法分离培养ADSCs,再经原代培养和传代培养.利用成骨诱导剂(10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L左旋抗坏血酸)诱导ADSCs向成骨方向分化,观察其生长形态,并通过Gomori改良钙钴法和yon Kossa染色对其成骨表型进行鉴定.另设一对照组.培养基中不加入成骨诱导剂.脂质体介导人内皮细胞生长因子(hVEGF)和骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)转染ADSCs细胞.观察转染后细胞形态和生长情况,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法分别检测hVEGFmRNA,BMP-2 mRNA及其蛋白质表达.结果:成骨诱导剂能显著诱导体外培养的ADSCs向成骨细胞分化,诱导19d的ADsCs体积增大,细胞由梭形变为多边形,Gomori改良钙钴法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒,诱导15d和19 d,碱性磷酸酶阳性细胞分别为(25.0±7.5)%和(49.7±6.9)%.von Kossa染色表明聚集的细胞团中央有钙化结节形成.RT-PCR检测证实.经质粒转染的ADSCS中hVEGF和hBMP-2基因表达明显增强,对照组呈弱表达.免疫组织化学检测证实转染ADSCs内有棕色的阳性颗粒出现,未转染细胞则呈现阴性.结论:ADSCs能被成功诱导为成骨细胞,hVEGF和hBMP-2基因能成功地转入ADSCs并表达,这为促进骨组织工程的血管化和成骨活性奠定了基础.
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Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞凋亡影响的研究
目的为了研究Mda-7/IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B凋亡的影响.方法构建了Mda-7/IL-24基因的真核表达载体pcDNA3.1/Mda-7/IL-24,用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcDNA3.1/Mda-7/IL-24和pcDNA3.1空载体质粒导入人肝癌细胞系Hep3B细胞中,经G418筛选获得细胞克隆.通过聚合酶链式反应(PCR)、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达,同时检测了细胞的生长和凋亡情况.结果pcDNA3.1/Mda-7/IL-24转染的Hep3B细胞能够检测到Mda-7/IL-24的表达,可以抑制细胞生长,DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的"梯状"条带,转染空载体和未转染的Hep3B细胞未见凋亡表现.结论将外源性Mda-7/IL-24基因导入Hep3B细胞后,可以促进凋亡,Mda-7/IL-24作为一种肝癌的治疗基因,具有广泛的应用前景.
