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乙型肝炎病毒感染基因转染模型研究进展
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所引起的严重危害我军广大官兵健康的主要传染病之一,严重影响着部队的有生力量,而HBV 感染也是导致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因.据总后卫生部信息中心全军医疗信息管理系统2000年部队所有驻军以上医院住院病例病案数据库首页显示,乙肝在部队的经济负担排名中位列首位,有必要采取有效措施减少乙肝的发病.因此,攻克乙型病毒性肝炎一直作为军队"九五、十五、十一五"计划的重点科研攻关项目.
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宫腔内脂质体转染技术在围着床期小鼠子宫内膜表达的研究
目的 探讨官腔内脂质体转染法对围着床期小鼠子宫内膜进行基因修饰的可行性.方法 于小鼠妊娠第2天(D2),通过宫腔内脂质体转染法分别介导绿色荧光蛋白基因,Meisl表达基因、Meisl小分子干扰RNA(siRNA)及其各自对照空载体进入孕鼠子宫内,于转染后第3天(D5)荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹和免疫组织化学法检测Meisl基因在基因转染上调组及其对照组,下调组及其对照组的表达变化.结果 绿色荧光蛋白可在小鼠子宫组织内表达;Meisl基因上调组其mRNA和蛋白水平明显高于对照组,而Meisl基因下调组其mRNA和蛋白水平明显低于对照组.结论 宫腔内脂质体转染法可以介导外源基因在小鼠子宫中表达,并可对小鼠子宫内膜着床相关基因的表达进行调控.
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1-01 c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型
目的建立促癌剂检测模型.方法采用电穿孔的方法,将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38及人支气管上皮细胞BEAS-2B中,将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后,进一步用促癌剂佛波醇酯(PMA)处理,并选用克隆形成率(CFE)、锚着独立性生长(AIG)、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测.结果 c-Ha-rasV12G基因使细胞对促癌剂的促癌敏感性增强,其中,对于WI-38G418r细胞,当PMA剂量分别为0、3.125×10-5、6.25×10-5、1.25 × 10-4、2.5×10-4及0.5×10-3mol/L时,其在含体积分数为1%FBS的1640培养基中的克隆形成率分别为7、8、11、12、15及14/200 cells,在含体积分数为10%FBS的培养基中分别为76、92、106、109、127及173/200 cells,在质量浓度为0.33%的琼脂中为47、61、70、69、80及97/1 000 cells.选取0.5×10-3 mol/L剂量组处理的G418r细胞进行裸鼠成瘤性实验,结果阳性.对照非基因转染细胞,用0.5×10-3 mol/LPMA处理后,在3种培养基中相应的克隆形成情况为3、33/200 cells,0/1 000 cells,裸鼠皮下注射部位无肿瘤生长.PMA以0、2.0×10-5、1.0×10-4、5.0×10-4、1.0×10-3及1.6×10-3 mol/L分别作用24 h,结果1.0×10-4 mol/L剂量作用使BEAS-2B G418r细胞获得了高的血清抗性及CEF,表现为在含体积分数为0.8%、0%FBS的LHC-8培养基及软琼脂中的CEF分别为190%、150%及75%(对照非基因转染细胞在不含PMA及FBS的LHC-8中CEF计为100%),对照细胞在含体积分数为0.8%FBS的培养基及软琼脂中不能生长,随着PMA处理剂量的增加,其CFE逐渐降低.结论 c-Ha-rasV12G基因可使上皮细胞BEAS-2B获得对PMA的促癌作用敏感性,其中当PMA剂量≤1.0×10-4mol/L时,可发挥促癌作用,大于该剂量则有促分化作用;上皮细胞发生恶性转化的标志之一是细胞对FBS、PMA等促分化剂的促细胞分化抗性增强.
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肝癌共刺激分子基因治疗的实验研究
目的:研究共刺激信号在肿瘤免疫中的作用.方法:脂质体介导DNA转移法将人B7基因转入人肝癌细胞株Smmc7721,建立新的细胞株B7+Smmc7721,PCR及逆转录PCR(RT-PCR)法鉴定.噻唑盐(MTT)比色试验体外检测白细胞介素-2(IL-2)激活的LAK细胞(LAK-C)对两种肝癌细胞的杀伤活性.结果:PCR,RT-PCR法证实B7+Smmc7721细胞稳定表达B7基因,LAK细胞对B7+Smmc7721细胞的杀伤活性明显高于Smmc7721,结果有统计学意义.结论:B7基因可以体外转染人肝癌细胞,并表达有活性的B7分子,B7分子可明显增强IL-2激活的LAK细胞的肿瘤杀伤作用,为进一步开展临床应用奠定基础.
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超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究
目的探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究.方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后可达高锋,持续3天左右,其后有些细胞荧光开始减退.结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性.
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重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨
目的:构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,hBMP-2)真核表达载体PcDNA3.1-hBMP-2,转染兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),种植去抗原牛松质骨(bovine canoellous bone,BCB)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响.然后将转染后细胞接种到BCB支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:在脂质体介导下,BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好,为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础.
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人BMI-1基因真核表达载体构建及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达
目的:构建人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1,转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞中并检测其表达.方法:RT-PCR检测Bmi-1 mRNA在乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-468细胞中的表达水平;从MCF-7细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,扩增Bmi-1基因序列,将含有Bmi-1全长编码序列的PCR产物经TA克隆后经PCR、酶切验证,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Bmi-1,转化至大肠杆菌后,酶切、测序鉴定;将重组质粒转染到MDA-MB-468中,48h后RT-PCR检测转染前后Bmi-1 mRNA及hTERT mRNA的表达变化.结果:Bmi-1 mRNA在MCF-7细胞中表达较高,而在MDA-MB-468细胞中仅适量表达.成功从MCF-7细胞中克隆获得Bmi-1基因并构建真核表达载体.转染后在MDA-MB-468中检测到Bmi-1 mRNA表达上调,其过表达上调hTERT mRNA的表达.结论:成功克隆和建立人Bmi-1基因真核表达载体;pcDNA3.1(+)-Bmi-1能在MDA-MB-468中表达;为进一步研究Bmi-1基因在细胞中的功能奠定了基础.
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Ad5F35重组腺病毒载体研究进展
在分子生物学领域,腺病毒载体是将外源基因导入动物细胞内经常使用的载体之一.由于其靶细胞种类多,转导效率高,对增殖期及静止期细胞均有很高的转导效率,不整合到宿主基因组中,不会引起插入突变,理化性质较稳定,易于分离纯化,可容纳较大的目的基因片段等优势,因而被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中,其中Ad5F35型腺病毒载体为近年来研究热点之一,此文就其研究进展作一综述.
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转染人乳头瘤病毒16型E6E7重组基因及感染模型细胞建立
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是性传播疾病的主要病原之一，高危型人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的关系已被肯定[1],在约50%～90%的宫颈癌组织中可检出HPV16 DNA.
关键词： 人乳头病毒16型E6E7基因 基因转染 基因表达 -
Ro60/SSA基因转染HEp-2细胞作为间接免疫荧光检测底物及其应用
本研究拟改造间接免疫荧光技术(IIF)抗核抗体(ANA)检测法的底物HEp-2细胞,建立抗60kDRo60/SSA抗体免疫荧光检测法.采用PCR扩增人源Ro60 cDNA,克隆入真核表达载体pEGFP-C1,并转染HEp-2细胞.通过荧光显微镜、免疫印迹法(IBT)及IIF鉴定转染细胞(HEp-Ro60)中Ro60-绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达和抗原性.分别以HEp-Ro60以及HEp-2为底物的IIF检测10份抗Ro/SSA对流免疫电泳(CIE)检测阳性、其他抗体阴性血清以及对照血清.获得的转染细胞传十几代后仍具有较强的Ro60-GFP表达,融合蛋白保持Ro60的抗原性.IIF检测中HEp-Ro60的滴度比HEp-2增加了6.7倍(P＜0.01),而且2例HEp-2细胞上IIF检测为阴性的血清在HEp-Ro60上为阳性.10例阳性血清中有8例出现了特征性荧光模式.结论是HEp-Ro60可用于IIF检测抗Ro抗体,并增加了ANA检出的敏感性.
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巯基烷基化壳聚糖载绿色荧光蛋白质粒基因纳米粒子的制备与研究
合成了新型的基因载体巯基烷基化壳聚糖(TACS),采用复凝聚法制备了巯基烷基化壳聚糖基因纳米粒子,并表征其形态和粒径.利用体外转染实验定性评估了纳米粒子的转染效率.结果 表明,粒子形态不很均一,粒径在390nm左右;凝胶电泳实验证明了载体能有效地包裹和保护基因不受DNase Ⅰ酶的消化;溶解实验证实了巯基化增强了TACS的水溶性;体外基因转染实验证实了TACS能够在人胚胎肾细胞(HEK293)转染基因,并且其转染效率远高于壳聚糖纳米粒子.这些结果 表明,巯基烷基化壳聚糖有望成为有价值的基因载体.
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pEGFP-VEGF165重组质粒的构建及在血管内皮细胞中的表达
采用PCR技术,从原核表达质粒PUC19-VEGF165中获得上下游含有Hind Ⅲ和BamH I酶切位点的目的基因VEGF165,与真核载体pEGFP-C1构建重组质粒pEGFP-VEGF165,观察其在内皮细胞中的表达.结果 表明,带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-VEGF165构建成功,并在PEI的介导下成功转染脐静脉内皮细胞(HUVEC),在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,ELISA检测证明VEGF在细胞上清中有效表达,RT-PCR证明了VEGF165 mRNA水平上的有效表达.此研究结果将为再狭窄的基因治疗提供实验基础.
关键词： 血管内皮生长因子(VEGF) 脐静脉内皮细胞 基因转染 -
hR24L基因转染对MCF7细胞凋亡的影响
为研究人类DNA损伤修复基因hR24L与细胞凋亡的关系,首先用PCR方法扩增了hR24L基因的开放阅读框(ORF),成功地构建了正义和反义hR24L基因的逆转录病毒表达载体重组体.然后用这两种重组质粒转染MCF7细胞,筛选出的阳性克隆再分别用过氧化氢、丁酸钠和去血清饥饿诱导凋亡,用Northern印迹杂交分析hR24L基因表达情况,用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡.结果发现转染正义hR24L重组载体的细胞的hR24LmRNA表达水平升高,其凋亡面积所占比例(21.21±2.42)比对照细胞(46.16±4.38)明显降低;而转染反义hR24L重组载体的细胞的hR24LmRNA表达水平则下降,但其凋亡峰面积所占比例(31.05±3.02)比对照细胞也明显降低,表明两者均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋亡,但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用.可见hR24L基因通过复杂的途径参与细胞凋亡的调控.
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人瘦素基因过表达增强大鼠骨髓基质细胞成骨能力
目的：探讨人瘦素（hLEP）基因修饰对大鼠骨髓基质细胞（rBMSCs）成骨能力的影响。方法以转染hLEP腺病毒载体（Ad5-hLEP-EGFP）的rBMSCs为实验组，空载体（Ad5-EGFP）转染的rBMSCs 和未转染的rBMSCs 为对照组。 MTT法检测细胞增殖情况，实时荧光定量PCR法检测Ⅰ型胶原（ Col-Ⅰ）和碱性磷酸酶（ ALP） mRNA的表达，茜素红染色检测矿化结节形成能力。同时，将各组rBMSCs与β磷酸三钙（β-TCP）复合后移植于裸鼠皮下培养8周，观察新骨形成情况。结果 Ad5-hLEP-EGFP能有效转染rBMSCs，转染后细胞增殖活性无明显改变，但Col-Ⅰ和ALP mRNA的表达较对照组有明显提高（ P＜0.05），矿化结节形成能力也更强（ P＜0.05）。而且， hLEP修饰后的rBMSCs能与β-TCP结合形成组织工程化复合物，并能在裸鼠体内形成更多的类骨样组织。结论 hLEP 修饰的rBMSCs可增强细胞成骨能力，有望应用于骨及牙周组织再生研究。
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外源性FHIT基因对人皮肤癌细胞系A431细胞增殖与凋亡的影响
目的 研究脆性组氨酸三联体基因(FHIT)对皮肤癌细胞系A431增殖与凋亡作用的影响,探讨FHIT基因在皮肤肿瘤发生发展中的作用.方法 脂质体介导的质粒pcDNA3-FHIT转染到有FHIT基因表达异常的皮肤癌细胞系A431,用G418对转染后细胞进行筛选,获得G418抗性的细胞用免疫细胞化学方法 进行FHIT基因表达鉴定.用MTT法、集落形成实验及流式细胞仪观察转染前后细胞生长特性的变化.结果 转染FHIT基因的A431细胞FHIT蛋白表达阳性,其增殖活性减弱、集落形成能力降低、凋亡率增加,且与对照组相比差异均有统计学意义.结论 导入外源性FHIT基因可以抑制皮肤肿瘤细胞A431的增殖,诱导细胞凋亡.
关键词： 抑癌基因 脆性组氨酸三联体基因 皮肤肿瘤 基因转染 凋亡 -
转染NDRG2基因抑制乳腺癌细胞增殖
目的 观察NDRG2对于乳腺癌细胞系增殖的影响.方法 用重组NDRG2腺病毒转染低表达NDRG2的人乳腺癌细胞系Bcap37,用Western blot检测NDRG2的表达;用MTT、流式细胞仪检测细胞增殖能力.结果 NDRG2的表达对Bcap37细胞生长具有抑制作用;Bcap37细胞病毒转染组出现G_1期阻滞(G_1期捕获),与未转染的Bcap37细胞(1.0%)和空载体重组腺病毒感染的Bcap37细胞(2.0%)相比,重组NDRG2腺病毒感染的Bcap37细胞中凋亡细胞明显增多,感染48 h后达12.0%,感染72 h后达21.5%.结论 在乳腺癌细胞系Bcap37中,过表达NDRG2可有效抑制细胞增殖并导致细胞周期的阻滞和诱导细胞凋亡.
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CYP2J3基因经静脉转染大鼠的组织分布
目的 观察CYP2J3基因转染后大鼠心、肝、肺、肾及胸主动脉CYP2J3基因表达和11,12-EET的含量.方法 经大鼠阴茎背静脉快速注射质粒复制大鼠转基因模型.将36只雄性Wistar大鼠(280-300 g)随机分为空白对照组、pcDNA3.1质粒和pcDNA3.1-CYP2J3重组质粒注射组,分别于14和28 d取材.用半定量RT-PCR法检测CYP2J3 mRNA表达,高效液相色谱法测定11,12-EET含量.结果 pcDNA3.1-CYP2J3重组质粒组28 d时各组织CYP2J3基因表达强于对照组和pcDNA3.1质粒组;各组织11,12-EET含量增高(P<0.05).结论 以pcDNA3.1质粒作为非病毒性载体,可增强同的基因CYP2J3在心、肺、肝、肾及胸主动脉的表达.
关键词： 细胞色素P450单氧化酶 CYP2J3 质粒 基因转染 EETs -
P38及上游激酶MKK6对热损伤诱导Raw264.7细胞凋亡的调控作用
目的 探讨P38及其上游激酶MKK6对热损伤诱导单核细胞系Raw264.7细胞凋亡的调控作用.方法 应用脂质体介导的基因转染将P38的显性负效突变体P38(AF)及具有持续活性的组成性活性突变体MKK6b(E)导入Raw264.7细胞,观察P38对细胞凋亡的调控作用.结果 荧光染色及Western blot检测显示,外源基因转染进细胞,并在细胞中得到表达;蛋白激酶活性检测显示,MKK6b(E)转染细胞系P38激酶活性明显升高,而P38(AF)转染细胞系P38激酶未被激活;流式细胞术检测显示,MKK6b(E)转染可明显诱导Raw264.7细胞凋亡,并且MKK6b(E)基因转染促进热损伤诱导的Raw264.7细胞凋亡,而P38(AF)基因转染抑制热损伤诱导的Raw264.7细胞凋亡.结论 MKK6-P38信号通路参与介导热损伤诱导的Raw264.7细胞凋亡.
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P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用
目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制.方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体,以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞,RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变.并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞,测定转染细胞荧光素酶报告基因活性.结果 1. 瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体pΔE1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后,其P53基因mRNA的表达明显增强;2. 基因转染后,SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低.3. P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后,其荧光素酶活性显著下降.结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性,并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现.
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反义MCP-1转染兔平滑肌细胞及对其生长的影响
构建逆转录病毒载体反义单核细胞趋化蛋白1(LUCX-Anti-MCP-1)表达质粒,利用阳离子脂质体(Lipofectamine)将反义MCP-1导入体外培养的平滑肌细胞,通过PCR、Northern杂交检测外源基因的转染及其mRNA表达情况.应用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法了解反义MCP-1基因对细胞生长的影响.结果显示:Lipofectamine可以成功的将反义MCP-1基因导入体外培养的主动脉平滑肌细胞中,并实现外源基因的转录表达.且反义MCP-1基因对体外培养的平滑肌细胞生长没有影响.
