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宫腔内脂质体转染技术在围着床期小鼠子宫内膜表达的研究
目的 探讨官腔内脂质体转染法对围着床期小鼠子宫内膜进行基因修饰的可行性.方法 于小鼠妊娠第2天(D2),通过宫腔内脂质体转染法分别介导绿色荧光蛋白基因,Meisl表达基因、Meisl小分子干扰RNA(siRNA)及其各自对照空载体进入孕鼠子宫内,于转染后第3天(D5)荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹和免疫组织化学法检测Meisl基因在基因转染上调组及其对照组,下调组及其对照组的表达变化.结果 绿色荧光蛋白可在小鼠子宫组织内表达;Meisl基因上调组其mRNA和蛋白水平明显高于对照组,而Meisl基因下调组其mRNA和蛋白水平明显低于对照组.结论 宫腔内脂质体转染法可以介导外源基因在小鼠子宫中表达,并可对小鼠子宫内膜着床相关基因的表达进行调控.
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RNR3调控的重组绿色荧光蛋白酵母细胞对化学诱变原的高通量筛选
目的 用RNR3调控的全发光酵母细胞高通量筛选化学诱变原.方法 以含有酵母嗜好遗传密码子的绿色荧光蛋白(yEGFP)报告载体为基本框架,用PCR方法从酵母(W303-1A)基因组扩增RNR3启动子,将其插入到yEGFP的上游,从而构建成RNR3调控的yEGFP酵母报告载体.用醋酸锂方法将载体转化于酵母细胞,构建成RNR3调控的yEGFP发光酵母细胞,可在96孔板中对不同浓度的化学诱变原进行筛选,具有快速、方便和高通量特点.结果 对数种不同的DNA损伤药物研究结果表明,DNA烷化剂(甲磺酸甲脂)、DNA断裂剂(顺铂)、DNA结合剂(放线菌素D)和DNA合成酶抑制剂(5-氟尿嘧啶和羟基脲)可诱导RNR3的表达,而苯丁酸氮芥和4-硝基-N-氧化喹啉由于细胞的毒性的作用,未使RNR3发生表达.结论 某些与致癌性有关的DNA损伤化学物能诱导RNR3表达,故该发光酵母细胞可用于对某些致癌物的高通量筛选.
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蛋白A-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建与表达
绿色荧光蛋白(GFP)是一种生物发光蛋白.GFP作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用.本实验将gfp基因与蛋白A基因重组,在大肠杆菌中融合表达为A-GFP蛋白.根据gfp基因与质粒载体pRIT2T的序列,设计一对引物,以PCR技术扩增gfp基因序列,克隆到表达载体pRIT2T的EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ酶切位点,与载体中的A蛋白基因融合.重组质粒转化大肠杆菌Top10,菌落在365 nm紫外光下呈现明亮的绿色荧光.本研究成功构建并表达了GFP与蛋白A的重组质粒,为开展GFP的研究及应用提供了生物工程工具的前体.
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超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究
目的探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究.方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后可达高锋,持续3天左右,其后有些细胞荧光开始减退.结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性.
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超声微泡造影剂促进GFP质粒转染喉癌细胞的效果
目的:观察超声微泡造影剂促进GFP质粒转染喉癌细胞的可行性及有效性.方法:将喉癌细胞随机分成4组,分别为A组:空白对照组(PBS);B组:GFP+微泡组;C组:GFP+超声组;D组:GFP+超声+微泡组,转染48h后,采用Western blot和RT-PCR检测喉癌细胞中GFP蛋白和mRNA的表达.结果:通过超声照射微泡造影剂促进GFP质粒转染喉癌细胞,D组中GFP蛋白和mRNA的表达量明显高于其他3组(P＜0.05),这说明D组的转染效率明显高于其余3组.结论:微泡在一定频率和强度的超声作用下能够安全、有效地将GFP质粒转染喉癌细胞.
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稳定表达EGFP的不同转移特性骨肉瘤细胞亚株建立及其生物学特性
目的:建立经绿色荧光蛋白基因转染的骨肉瘤细胞亚株并研究其生物特性.方法:利用脂质体转染pEGFP入人骨肉瘤MG63细胞系,通过细胞电泳,获得两株细胞克隆M6和M8,经体外细胞增殖、软琼脂形成、生长曲线、裸鼠成瘤试验综合分析其生物学行为改变.应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法研究癌细胞的生物学特性.结果:发现M6和M8两株均保持人类染色体核型,所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态,其中M6的群体倍增时间为38.4 h,软琼脂形成率为18.7%,M8群体倍增时间为23.0 h,软琼脂形成率为29.3%.裸小鼠背部皮下接种M6和M8,发现M8成瘤时间短,细胞增殖快,但在4周内两者均不发生转移.结论:骨肉瘤细胞亚系有不同的转移特性,GFP的整合及表达未对MG63细胞的生长状态造成明显影响,可作为报告基因进一步了解骨肉瘤细胞转移的差异性分析.
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绿色荧光蛋白在大肠杆菌O157∶H7检测中的应用
目的将绿色荧光特征引入大肠杆菌E.coli O157∶H7,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究. 方法将pGFP质粒转化E.coli O157∶H7,构建一种工程菌(E.coli O157∶H7- pGFP),并进行了选择性培养基的筛选.以E.coli O157∶H7- pGFP对鸡肉与牛奶等食品样品进行接种与回收试验,同时设定不同温度模拟食品储存的不同情况.结果 pGFP质粒可以在E.coli O157∶H7菌株中稳定存在.将E.coli O157∶H7-pGFP接种食品样品,以LBan培养基平板回收发现:较高温度存放肉类与牛奶,其污染的E.coli O157∶H7菌量可在12 h增加35 000～200 000倍,而4℃存放可以使污染菌量缓慢下降.结论构建了一种具有紫外灯下发出绿色荧光与氨苄青霉素抗性等特性的重组菌株--O157∶H7-pGFP,并设计了适合E.coli O157∶H7-pGFP生长的选择性培养基--LBan.该重组菌株可应用于检测方法的改进及该菌特性的研究,是一种非常有用的工程菌.
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土贝母皂苷对转染绿色荧光蛋白基因人乳腺癌细胞MDA-MB-231(GFP)、 MCF-7 (GFP)的作用
目的 观察土贝母皂苷对转染绿色荧光蛋白(GFP)基因的人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7的体外抗肿瘤活性. 方法 采用倒置光学显微镜观察土贝母皂苷作用下转染GFP基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7形态学变化,MTT法检测土贝母皂苷对两种乳腺癌细胞的生长抑制作用.结果 土贝母皂苷作用24 h后,两种人乳腺癌细胞均表现出典型凋亡形态改变;MTT结果显示土贝母皂苷对两种乳腺癌细胞的生长具有强抑制作用,MDA-MB-231 (GFP)、MCF-7 (GFP)经土贝母皂苷作用48h后的IC50分别为(17.03 ±3.22)、(27.96±0.34) μg/ml. 结论 土贝母皂苷对两种人乳腺癌细胞均有较强的抑制作用.
关键词： 土贝母皂苷 绿色荧光蛋白 MDA-MB-231 MCF-7 凋亡 -
表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建
为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增.并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒.采用体外拼接策略,将Bsa Ⅰ酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5'端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3'端具有polyA尾巴结构.然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA.脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救.结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性.本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础.
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表达绿色荧光蛋白嵌合狂犬病病毒HEP-GFP株的拯救
狂犬病毒(Rabies Virus,RV)是人和犬、猫等多种动物狂犬病的病原,其基因组是单股负链RNA,基因组结构为3'-核蛋白(N)基因-磷蛋白(P)基因-基质蛋白(M)基因-糖蛋白(G)基因-大蛋白(L)基因-5'.
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胆碱能前体细胞移植入β-淀粉样前体蛋白转基因小鼠脑内的存活和迁移
目的 观察新生小鼠海马原代培养的胆碱能神经前体细胞移植人淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)转基因小鼠脑内以后的存活和迁移状况,以探索胆碱能神经前体细胞对阿尔茨海默病的治疗前景.方法 取新生24h以内增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因小鼠,以原代细胞分离培养方法获得海马胆碱能神经前体细胞,以前体细胞特异性标记抗巢蛋白(Nestin)和胆碱能细胞特异性标记胆碱乙酰基转移酶(cholineacetyltransferase, ChAT)做细胞免疫组化鉴定细胞特性.细胞培养成功后,收集细胞,在小鼠脑立体定位仪的固定下,参照小鼠脑立体定位图谱对APP转基因小鼠施行脑内注射.移植1周以后灌注取移植鼠脑组织行冰冻切片,在共聚焦显微镜下通过外源细胞的绿色自发荧光观察移植细胞的存活和迁移情况.结果 在移植位点,外源性绿色荧光细胞存活良好并以移植点为中心向外迁移,且呈继续迁移的趋势.结论 新生小鼠海马原代细胞培养以后呈现神经前体细胞的特性并且胆碱能阳性,移植入APP转基因小鼠脑内以后,这些胆碱能阳性的神经前体细胞存活良好并呈现较强迁移能力,为进一步探索该细胞对阿尔茨海默病的治疗可能性提供了依据.
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硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白载体的构建及在293T细胞中的分布
目的 构建硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白真核表达载体,并在293T细胞中得到表达和定位.方法 以RT-PCR方法从PC12细胞中克隆氧化/还原因子(APE/ref-1)的cDNA,然后亚克隆构建APE/ref-1-GFP融合真核表达载体.以PCR方法将质粒pQE30-TRX上的硫氧还蛋白cDNA亚克隆到pDsred1-1质粒上,然后将硫氧还蛋白-DsRed融合基因序列亚克隆到pCMV5质粒上,构建硫氧还蛋白-DsRed融合真核表达载体.通过磷酸钙转染293T细胞,以荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位.结果 成功构建了硫氧还蛋白-DsRed和APE/ref-1-GFP融合表达载体,并在293T细胞中得到表达,APE/ref-1-GFP融合蛋白定位在293T细胞核内;硫氧还蛋白-DsRed融合蛋白定位在293T细胞质和细胞核内.结论 为进一步研究硫氧还蛋白和APE/ref-1之间的动态相互作用奠定基础.
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内部核糖体进入位点控制hytk基因和绿色荧光蛋白的表达
构建一种带有绿色荧光蛋白基因(gfp)和hytk cDNA(潮霉素磷酸转移酶和HSV-tk的融合基因)的新型真核表达载体,用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率.利用脑炎心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),将gfp的cDNA与hytk真核表达载体重组,构建获得含gfp和hytk基因的重组质粒;Lipofectin介导下分别转染COS-7细胞及人膀胱癌细胞株EJ,并检测其表达情况.结果示该载体在瞬时表达及稳定表达时均可获得hytk及gfp的良好表达.说明含gfp和hytk基因双顺反子真核表达载体的构建成功,为临床应用自杀基因治疗膀胱恶性肿瘤提供了新的治疗工具及随访检测手段.
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大鼠骨髓基质细胞在脑内的迁移和分化
目的 研究骨髓基质细胞(bMSCs)在大鼠脑内的迁移和分化情况.方法 体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8～10 d后,同时用含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒上清转导bMSCs并进行抗性筛选,7～10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,然后将EGFP标记的bMSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内,进而观察bMSCs向脑内迁移和分化的情况.结果 在移植后的大鼠脑内均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs,这些EGFP阳性的细胞呈现出一些神经元和神经胶质细胞的形态并能表达一些神经元和神经胶质细胞的特异性标志物.结论 骨髓基质细胞中确实含有能够向神经元方向分化的干细胞.
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EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证
目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.
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AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位
构建以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem104-pEGFP-N1,利用脂质体转染体外培养的COS-1细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem104-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位,用RT-PCR和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达.结果表明在空载体pEGFP-N1转染组中,COS-1细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒AngRem104-pEGFP-N1转染组中,绿色荧光集中在细胞核中,随着表达量的增高,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状、颗粒状.RT-PCR的结果表明AngRem104在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组.Western blot的结果也确证了AngRem104-EGFP融合蛋白的表达.提示新基因AngRem104/pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS-1中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有AngRem104和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为基因功能研究提供了线索.
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携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定
目的 构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性.方法 从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序.按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率.测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位.结果 构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致.转染后48 h,荧光蛋白表达佳,转染率为18.6%±1.6%.从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位.结论 成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具.
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慢病毒介导绿色荧光蛋白转染人胚胎干细胞及其培养
目的 稳定培养人胚胎干细胞,并通过慢病毒载体对其进行绿色荧光蛋白标记.方法 利用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层或Matrigel作为基质培养人胚胎干细胞,包装带有GFP序列的慢病毒转染人胚胎干细胞.对转染前后的人胚胎干细胞进行了碱性磷酸酶和SSEA-3免疫组化鉴定.结果 在MEF饲养层和Matrigel上均可培养出呈克隆样生长,表达标志抗原的人胚胎干细胞,经慢病毒转染及抗生素筛选后仍可稳定表达GFP.结论 成功地培养了人胚胎干细胞系,并进行了GFP标记.
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优选人脱细胞真皮基质及荧光标记示踪与其复合培养的成纤维细胞
目的 优选人脱细胞真皮基质(ADM)并评价其生物学特性. 方法 通过高渗盐-NaOH消蚀法(A组)、高渗盐-十二烷基硫酸钠(SDS)法(B组)和DispaseⅡ-Triton X-100法(C组)制作人脱细胞真皮基质,以特殊染色、免疫组织化学观察3种方法 制作ADM的组成成分;四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞毒性实验评价3种方法 制作ADM的细胞毒性反应;细胞培养法评价其细胞相容性,优选ADM .重组腺病毒绿色荧光表达载体(Ad-GFP)转染的人成纤维细胞(FB)接种在优选ADM上,荧光显微镜观察 FB的生长情况. 结果 3种方法 均能够保留胶原纤维、弹性纤维, A组和C组能够完全脱去细胞,B组未能完全脱去细胞;A组和B组制备ADM细胞毒性反应小于1级;C组制备ADM细胞毒性反应大于1级.A组与B组24h 3T3细胞贴壁数有统计学意义( P <0.05),3T3细胞能够在A组ADM表面贴附;优选A组ADM.转染Ad-GFP的FB在优选ADM上生长和增殖良好. 结论 高渗盐-NaOH消蚀法制备的ADM蕴涵丰富的生物信息,细胞毒性小,生物相容性好,是一种很好的生物支架材料.
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不同类型的转基因细胞核供体对生产小鼠转基因克隆胚胎的影响
目的 利用体细胞核移植(SCNT)技术生产小鼠转基因克隆胚胎. 方法 利用所构建的含新霉素抗性(Neor)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体, 通过电穿孔的方法, 分别转染小鼠胎儿成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞,经G418筛选14d后用于核移植.同时以未转基因小鼠卵丘细胞和成纤维细胞为核供体,进行体细胞核移植. 结果 转基因与未转基因胎鼠成纤维细胞的重构胚的囊胚(154/160)发育率为19.23%和22.91%,差异不显著(P＞0.05);转基因胚胎干细胞与胎鼠成纤维细胞的重构胚的囊胚(152/154)发育率为41.54%和19.23%,差异显著(P＜0.05);未转基因卵丘细胞与成纤维细胞的重构胚的囊胚(171/160)发育率为41.17%和22.91%,差异显著(P＜0.05). 结论 利用体细胞核移植技术,小鼠胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞可以有效地生产小鼠转基因囊胚.
