首页 > 文献资料
-
表达H120 S基因膜外区段的重组鸡传染性支气管炎病毒的拯救
为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,构建了含有上述区段的重组IBV cDNA克隆BeauR-H120 (S1).然后直接将BeauR-H120(S1)作为DNA模板在体外转录出病毒基因组RNA,该转录产物电转入Vero细胞后48h收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得一株重组IBV(rBeau-H 120(S1)).通过RT-PCR方法证明rBeau-H120(S1)基因组中包含有完整的H120纤突基因膜外区段.Western-blot试验证实rBeau-H120 (S1)的N蛋白有表达,表明重组病毒在Vero细胞内进行了增殖.经连续传代后测定rBeau-H120 (S1)的TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度为106.13±0.23EID50/mL.免疫保护实验表明,在接种重组病毒21d时,鸡群抗体阳性率达到90％,使用强毒株M41(103 EID50/只)攻毒时免疫保护率为85％.本研究采用反向遗传操作技术构建的重组IBV,为进一步研制IBV重组基因工程疫苗奠定了基础.
-
中国1995～2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析
应用RT-PCR方法扩增到了我国1995～2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白(Membrane,M)基因片段.序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672～681bp组成,编码由223～226个氨基酸残基组成的多肽.与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2～17位、221～223位,其中4～6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异.与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群.我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切.此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组.
-
广西不同时期IBV分离株S1基因高变区Ⅰ的遗传变异分析
对广西1985～2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒(IBV)的S1基因高变区Ⅰ(HVR Ⅰ)进行序列测定,并与发表的其他IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析.系统进化关系显示毒株可分为5个基因群,其中有16个广西分离株属第Ⅰ群,它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高,与Massachusetts(Mass)型疫苗株的同源性较低.有15个分离株在33～34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入,GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入;GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系近,同属于第Ⅱ群;GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系近,属于第Ⅲ群;GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4/91亲缘关系较近,属于第V群.结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行,毒株S1基因HVR Ⅰ碱基的突变或插入比较普遍,可导致其氨基酸序列的变化,绝大部分毒株与目前常用的Mass型疫苗株的亲缘关系较低.同一时期的分离株同源性较高,但无明显的地域性差异.
-
鸡传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列分析
为了明确传染性性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/SD09/005的分子特征,以进一步丰富国内IBV的分子流行病学信息.本研究设计了25对引物对其全基因组进行了序列测定,并与参考株进行了同源性比较和S1基因遗传进化分析.结果显示CK/CH/SD09/005基因组为27 691bp(不包括5'端Cap和3 '端Poly A).全基因组同源性比对发现,CK/CH/SD09/005仅与GenBank中广西2009年分离株GX-NN09032各基因高度同源(97％～99％).除GX-NN09032外,CK/CH/SD09/005基因组5'端复制酶基因(Gene 1)和3'端非转录区(Untranslated region,UTR)与2个QX基因型参考株ck/CH/LDL/091022和SDIB821/2012同源性高,分别为97％和98％,但是3'端结构蛋白和非结构蛋白基因(S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N)与这两个毒株同源性较低,仅为72％～90％.其ORF3c/E、5a、5b和N分别与韩国分离株1011、国内分离株CK/CH/LXJ/02I、DK/CH/HN/ZZ2004和YX10同源性高,分别为97％、96％、99％和96％,而其ORF3a、3b和M与参考株同源性均低于90％.S1基因遗传进化分析发现,CK/CH/SD09/005和国内外39个参考株形成7个进化分支(基因型),CK/CH/SD09/005和2007以来几个分离株属于基因Ⅳ型,与其它6个基因型参考株S1和S2基因同源性为66％～69％和72％～81％,S1基因不仅表现广泛性点突变,而且有多处碱基插入和缺失,S2仅表现点突变.本研究结果表明CK/CH/SD09/005是一个变异株,可能是QX基因型IBV流行株与其它毒株重组进化而来,此外还涉及基因突变、插入和缺失等多种变异机制.
-
禽支气管炎病毒Jin-13分离株在SPF鸡体内的动态分布
本研究旨在掌握禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染SPF鸡后在体内的动态分布.针对IBV流行毒Jin-13株N基因设计并合成一对引物,建立了检测IBV Sybr green Ⅰ荧光定量PCR方法.人工感染90日龄SPF鸡1、4、7、10、14、21、28和35d后检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、气管、肾脏和十二指肠等内脏器官病毒载量,以研究体内病毒复制动态及分布情况.该方法在7.77×108～100拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中7.7拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR方法敏感100倍.结果表明鸡群从感染后第4日开始发病,各组织器官内IBV病毒含量逐渐升高,至第7日肾脏病毒含量高达到7.13×104拷贝/μL,其余依次为气管、肺脏、脾脏、心脏、肝脏和十二指肠.攻毒10日后各组织内含量均逐渐降低.肝脏于攻毒后21日时已检测不到IBV.于攻毒后第28日肾脏、气管和肺脏仍能检测到IBV.心脏可持续带毒35d.本研究从组织嗜性和动态分布方面为解释了IBV Jin-13株感染后的持续排毒及其严重的致肾损伤现象.
-
番鸭源传染性支气管炎病毒PTFY株的分离鉴定
为弄清楚2009年7月某种番鸭养殖场产蛋高峰期番鸭产蛋率、孵化率降低,蛋质量下降的原因,选择无呼吸道症状,死亡率低,剖检可见卵巢肿大充血的番鸭.为确诊该病例,进行病原体的分离与鉴定.取病番鸭卵巢组织,通过鸡胚接种实验、脂溶剂敏感实验、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)干扰试验、电镜观察和动物接种实验进行病毒分离和鉴定.结果表明:接种鸡胚可导致侏儒胚,该毒株对于脂溶剂敏感,胰酶处理后具血凝性,可干扰NDV复制,电镜下可见典型冠状病毒形态,接种雏鸡可致呼吸道症状,针对N基因部分序列的扩增与分析可见该毒株与传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)参考毒株相应核苷酸序列同源性为84.7％～99％,鉴定所分离毒株PTFY株为IBV,证实IBV对番鸭具有致病性.
-
2012～2013年鸡传染性支气管炎病毒广西分离株S1基因序列分析与血清型鉴定
为继续跟踪了解近年来广西鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的流行状况及抗原变异情况,本研究对2012～2013年的15个广西IBV分离株S1基因进行了相似性比较、进化树和重组分析,同时鉴定了分离株的血清型.结果表明,15个IBV毒株之间的S1基因氨基酸序列相似性为54.3％～99.6％,与参考株的相似性为43.3％～99.3％;除GX-YL130025外,其余14个毒株与疫苗株H120的相似性均较低(65.1％～81.4％);进化树分析表明,15个IBV分离株分属8个基因型,其中New-type Ⅱ为优势基因型;重组分析表明,分离株GX-NN130048的S1基因来源于4/91疫苗株和LX4型野毒株的重组;血清分型结果表明,15个IBV分离株分属7个血清型,与生产上广泛使用的疫苗株H120血清型一致的仅有1株,重组毒株GX-NN130048的血清型不同于其亲代血清型.本研究表明,近年广西地区IBV不管是在基因型还是血清型上都发生了明显的变异,同时存在多个基因型和血清型的流行;基因重组可导致新血清型的出现,这可能是导致免疫失败的主要原因.本研究为全面阐述IBV变异规律和分子机制以及为新疫苗的研发提供依据.
-
中国1995～1999年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析
应用RT-PCR方法扩增到了我国1995～1999年10株IBV现地分离株的核蛋白基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析.结果发现,10株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失.与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的毒株主要分布于3个群中,该3群病毒主要包括我国IBV现地分离株.对n基因及其局部功能区序列比较发现,我国分离株与H120疫苗株N蛋白存在广泛的氨基酸变异.通过与s1基因系统发育进化树比较发现,我国IBV分离株存在基因重组现象.以上结果表明我国1995～1999年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象.
-
表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建
为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增.并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒.采用体外拼接策略,将Bsa Ⅰ酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5'端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3'端具有polyA尾巴结构.然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA.脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救.结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性.本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础.
-
传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)S2蛋白基因的序列测定和分析
根据GenBank上发表的IBV S2基因序列,自行设计了两对引物,分别扩增SD/97/02株S2基因的上游1100bp部分和下游的900bp部分,两段序列拼接后包含了S2全基因的序列.将此两段分别克隆入pGEM T-easy载体,测序后将序列用分析软件DNASTAR和网上的BLAST软件进行分析,结果表明,S2基因比S1基因相对来说更保守,位于氨基酸第560～600位很可能是与囊膜锚着的部位,而S2与S1的交界处以HRRRR为特征,这不同于常规的RRF/SRR.
-
鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LX4纤突蛋白基因分子特征
应用RT-PCR方法分别扩增了中国地方分离株IBV LX4 S1和S2基因并进行了基因的克隆和序列测定.结果发现,LX4 S基因由3495个核苷酸组成,编码一条1164个氨基酸残基组成的多肽.S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由539和625个氨基酸残基组成.LX4 S基因推导氨基酸切割识别位点序列为HRRRR,与A2、SD/97/02和Z株相同,而与其它国内外参考毒株不同.与国内外10株已报道的具有全S基因序列的IBV参考毒株比较,LX4与国内分离毒株SD/97/02的核苷酸和氨基酸同源性高.与32株国内外参考毒株的S1基因进化树分析比较表明,LX4与A2、SD/97/02、Z、TJ/96/02、JX/99/01和SAIBWJ等7个国内分离株在同一亚群内.在该亚群内,LX4与A2和SD/97/02亲缘关系更近,且三者在高变区和抗原表位均具有高度的同源性,而与本亚群内其它参考毒株对应的高变区和抗原表位同源性差异较大.LX4与H120 S1基因编码氨基酸的同源性虽然高于其它国外参考毒株,但同源性仍然较低,为75%.与参考毒株比较,LX4 S2基因的点突变造成其推导的氨基酸序列有11个位点发生改变,这些突变可能影响S2与S1蛋白之间的相互作用,从而影响S蛋白与特异性抗体的结合.
-
不同组织嗜性传染性支气管炎病毒核衣壳基因的遗传变异性分析
根据GenBank发表的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株核衣壳(nucleocapsid,N)基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法分别扩增了疫苗毒株IBV-H52、嗜腺胃ZJ971株、嗜肾IBV-X和N株的N基因ORF,并克隆到质粒载体pBluescript SK(+),测序后用PCgene和DNA Star软件分析.结果显示:4株IBV的N基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码一由409个氨基酸残基组成的N蛋白.嗜肾IBV-X和N毒株的N基因存在Hind Ⅲ酶切位点.与来自GenBank的另外8株IBV比较,ZJ971株与它们的N蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分别在88.2%～98.6%和91.2%～97.8%;N株则分别为86.6%～87.4%和90.5%～91.5%;X株分别为86.3%～87.4%和90.0%～91.5%;H52分别为90.4%～98.3%和92.0%～98.0%.ZJ971株、N和X株的N基因的突变特点是散在的点突变.嗜腺胃ZJ971株核衣壳蛋白的氨基酸序列的显著的遗传变异特征是H111D、S117A、V142L、P171A和E401D;嗜肾IBV-X和N株核衣壳蛋白的氨基酸序列的显著的遗传变异特征是A46S、A48P、L189R、N190S、E220D、I223A、V236Y、S237K、K240Q、Q286R、T299K、R301E、E334D、V335E、V336P和T351S.
-
鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗原性初步研究
为了研究重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白能否作为群特异性诊断抗原加以应用,将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4核蛋白基因亚克隆于大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组质粒pPROEXTMHT-N.经核苷酸序列测定后,阳性质粒转化大肠杆菌DH5α,并进行诱导表达.表达产物经SD S-PAGE、Western blot鉴定,表明核蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达产物是分子量分别为约56kD和45kD的蛋白,其中分子量为56kD的蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%.包涵体被6mol盐酸胍裂解后,通过镍离子亲和树脂进行了纯化,并用纯化的分子量为56kD的重组蛋白免疫新西兰白兔,所获得的兔抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白多克隆抗体,分别与不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒进行琼脂扩散反应,结果表明 ,该多克隆抗体可与各不同致病型毒株发生反应.这初步表明重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白,可作为群特异性诊断抗原用于该病毒的诊断中.
-
广西2009～2011年鸡传染性支气管炎病毒分离株的基因分型及血清分型
为了解广西地区1985年以来传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的流行情况及跟踪其基因和抗原的进化,通过病毒基因扩增与序列测定技术以及鸡胚气管环中和试验,分别对2009～2011年间分离的28个广西地方IBV毒株进行基因分型和血清分型.毒株基因序列测定与比较分析的结果表明,28个IBV分离株在N基因的进化关系可分成3个主要的基因群,其中大多数毒株属于第Ⅲ群,而之前1985～2008年的流行毒株则属于第Ⅳ群和第Ⅱ群;病毒中和试验的结果表明,28个IBV分离株分属于6个不同的血清型,其中血清1、2和3型共占71.4％,与现用疫苗株血清型一致的毒株共有11个(占39.3％).结合本课题组之前的研究结果进一步的分析还发现,广西不同地区存在不同血清型的流行且不同时期流行的血清型及其所占比例也不尽相同.本研究为研发和应用包含多个优势血清型的多价灭活油苗奠定了很好的基础.
-
新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重DNA微列阵鉴定方法的构建
目的 建立可同时检测新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV)的多重DNA微列阵鉴定方法. 方法 针对NDV和IBV设计PCR引物和微阵列探针,制备检测用微阵列.将样品与微列阵进行杂交,分析微阵列的特异性和灵敏度. 结果 建立的微阵列检测NDV和IBV为阳性,且能区分NDV和IBV,而流感病毒传染性法氏囊病毒等阴性对照无杂交信号.通过GenePix 4.1软件分析杂交信号的平均SNR532,NDV和IBV的检出限为1×103 copies/μl. 结论 建立的多重DNA微列阵鉴定方法具有高特异性和高敏感性,可用于NDV和IBV感染检测.
-
IB-ELISA诊断试剂的研究
目的为鸡群日常监测传染性支气管炎病毒(IBV)抗体提供一个方便、特异、快速的检测方法.方法利用9日龄SPF鸡胚尿囊腔接种培养IBV,以及鸡胚成纤维细胞传代培养IBV,经纯化后,测定蛋白含量,作为包被抗原,利用过碘酸盐法标记兔抗鸡IgG作为酶结合物,用TMB作为显色剂,建立起酶联免疫吸附试验(ELISA)技术,检测血清样品中传染性支气管炎抗体.结果上述两种方法制备的抗原皆可用于此试验,与NDV、MDV、IBDV、AIV、APIV、REV、ILTV、Ic、MG、MS等抗血清无交叉反应,与IDEXX IB-ELISA比较,结果吻合较好.结论本研究制备的IBELISA诊断试剂,可用于日常监测传染性支气管炎病毒抗体.
-
传染性支气管炎病毒血凝抗原的制备
目的 利用磷脂酶C处理,制备传染性支气管炎病毒(IBv)血凝抗原.方法 将IBV接种9日龄SPF鸡胚,48 h后收获尿囊液,经过高速离心浓缩,利用胰酶、产气荚膜梭状芽孢杆菌培养液(含磷脂酶C)处理后,进行常规血凝和血凝抑制试验.结果 经过胰酶处理的IBV具有非常强的非特异性.而经过磷脂酶C处理的IBV,该凝集作用可被特异的IBV抗血清所抑制,而不能被ILTV、NDV、Adeno-1和Adeno-3,APIV、AIV、IBDV、HP、MS和MG等抗血清所抑制.结论 磷脂酶C处理的IBV,可以用于血凝抑制试验.
-
中国2000-2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析
对2000-2004年从中国9个省市分离到的13株IBV的核蛋白基因片段进行序列测定及分析的结果表明,13株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1230bp的ORF,但存在基因突变现象.与GenBank中的42株参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,系统进化关系显示55株IBV毒株分属于9个群.第Ⅰ-Ⅲ群主要包括美国、日本、荷兰等国家以及中国的部分IBV分离株和疫苗株.其中本研究中的CK/CH/LHN/00I可能为一株分离的疫苗毒,CK/CH/LSD/03I、CK/CH/LDL/01I可能为重组毒.而中国近十年来分离的IBV毒株主要分布在第Ⅵ-Ⅷ群中,此3群内IBV毒株之间N蛋白推导氨基酸同源性为88.3%～100%,与其他各群之间同源性为62.3%～95.1%.因此,此基因型的IBV毒株可能在中国已有较长时期的存在且发生了较大程度的变异.其中第Ⅵ群中两株韩国分离株与中国IBV分离株具有较近的亲缘关系.以上结果表明,中国大多数IBV分离株在N基因进化关系上较为独立,与国外毒株相比,和韩国毒株进化关系密切.此外,中国IBV毒株基因重组现象更加普遍,尤其是疫苗毒和野毒之间的重组.
-
鸡传染性支气管炎病毒LX4株mRNA5和mRNA6 cDNA的分子特征
本研究参照已发表的IBV基因序列设计合成了一对引物,经反转录-聚合酶链式反应(ReverseTranscription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术扩增得到我国地方分离株LX4 mRNA5和mRNA6的全部cDNA大小约1.7kb的片段.将该片段克隆并进行序列测定,与国内外部分参考毒株的相应序列比较分析发现:LX4 5a基因与已发表的国内外IBV毒株之间同源性很低,而这些参考毒株间5a基因同源性却很高(推导的氨基酸同源性在90%以上).5b基因与国内分离株D971同源性高.在所选的12株参考毒株中,LX4N基因推导氨基酸同源性与国内分离株SD/97/02高(94%),与HB次之(93%),与其他毒株核苷酸和推导氨基酸同源性在谮89%和92%以下.对已报道的N基因所编码蛋白的三个保守碱性区同源性比较发现,LX4在第66-88位与Beau、M41、H52及HB同源性均为100%.在第181-234位,推导氨基酸同源性与SD/97/02高(94%).在第334-373位推导氨基酸同源性与H120和ZJ971推导氨基酸同源性均为93%,与其他毒株在82%以下.同时还发现在C末端350-409位,LX4与H120推导氨基酸的同源性为100%,与HB次之(98%),与其他毒株在95%以下.以上研究结果提示:我国地方分离毒株LX4 mRNA5和mRNA6cDNA序列与国内其他分离株高,表明与国内其他分离株具有较近的遗传衍化关系.但在N基因序列比较及对N基因编码蛋白的局部功能区比较分析发现,LX4与H52和/或H120存在很高的同源性,这表明LX4的存在可能与我国应用IBV疫苗株H52和H120有一定的联系.
关键词： 传染性支气管炎病毒 mRNA5和mRNA6 cDNA 分子特征 -
传染性支气管炎病毒江苏分离株核蛋白基因序列测定与同源性分析
将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株 JS/95/03接种鸡胚，分离、纯化病毒，提取单股RNA做为反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物，使用单管RT-PCR方法，特异扩 增IBV核蛋白（N）基因5'端854?bp的片段。扩增产物纯化后测序,序列分析表明，IBV N基 因也存在较大变异，此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性高。
