uPA基因的克隆

目的:构建uPA真核细胞表达质粒.方法 根据GenBank中uPA的序列,利用RT-PCR从人卵巢癌组织进行扩增uPA基因全长片段,将其克隆人真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his(一)B,建立uPA的表达质粒pcDNA3.1-uPA,后并对克隆的全长片段进行DNA序列测定.结果 经与GenBank分布的序列进行分析比较证实,构建的真核表达重组质粒pcDNA3.1-uPA含有uPA全长cDNA编码序列.结论 uPA能被成功地从人卵巢癌组织中克隆,构建丁真核细胞表达质粒pcDNA3.1-uPA,测序表明其携带有uPA的全长序列,为进一步研究uPA在卵巢癌侵袭转移中的作用打下基础.

树（鼠/句）载脂蛋白CⅡ的cDNA和蛋白质结构分析

以从树（鼠/句）肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART-RACE技术,获得了树NEA4DapoCⅡ的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较.结果显示,树NEA4DapoCⅡ cDNA序列(在GenBank中的注册号为AF335585)长483 bp,其中开放阅读框架306 bp,编码101个氨基酸的前原蛋白,其蛋白原由79个氨基酸组成.树NEA4DapoCⅡ的氨基酸顺序与人、猴、狗的同源性分别为86%、87%和81%.与人及其它种属动物的相同序列比较显示,树NEA4DapoCⅡ分子C-端激活LPL功能区比N-端脂质结合区更具保守性.

Par6A cDNA的克隆与表达

目的 探讨Par6A基因的克降表达及功能.方法 用RT-PCR从大鼠L6骨骼肌细胞扩增出Par6A的cDNA,利用分子克隆的方法 构建Par6A的克隆载体以及真核表达载体,在293细胞中进行表达,通过免疫共沉淀初步研究Par6A的功能.结果 成功扩增出Par6A cDNA,片断大小约1 kb,并构建了真核重组表达质粒pDsRed-Express-N1-Par6A.在转染293ET细胞24 h后,荧光显微镜下可见红色荧光的表达.免疫共沉淀实验表明Par6A与PKCζ存在相互作用.结论 成功扩增出大鼠骨骼肌的Par6A cDNA,为研究Par6A的相关功能奠定了基础.

扩展莫尼茨绦虫基因芯片的制作及分析

通过EST计划获得1 080个基因片段,制备了扩展莫尼茨绦虫cDNA芯片.该芯片一个域有52行、78列,密度为863点/cm2,其中包含1 080个靶基因、9个阳性对照、16个阴性对照、8个空白对照,每个基因做3个重复.用扩展莫尼茨绦虫的成节与头颈节总RNA与芯片进行杂交,获得了成节与头颈节基因表达谱,芯片结果分析差异系数为0.1807,共找到91个在扩展莫尼茨绦虫成节高表达基因,幼节高表达基因81个,其他的基因表达差异不大.通过同源性比对分析,成节高表达基因主要有钙调节蛋白、外致密纤维精子尾、富含半胱氨酸蛋白前体和卵黄蛋白原等;头颈节高表达基因主要有果糖-二磷酸盐醛缩酶、皮层细胞蛋白和胶原等.该芯片可以进一步应用于扩展莫尼茨绦虫基因组等方面的研究,对基因表达差异进行高通量检测.

粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA原核表达质粒的构建与表达

目的构建粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒,并在大肠埃希菌中表达. 方法采用亚克隆技术,用SacⅠ和NotⅠ从重组质粒pMD-18T- Der f 2上切下Der f 2 cDNA片段,插入表达载体pET-32a(+)质粒,转化大肠埃希菌BL21,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定.重组质粒pET-32a(+)-Der f 2转化大肠埃希菌,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析. 结果对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得455 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,证明已成功构建携带Der f 2基因的重组原核表达质粒pET-32a(+)-Der f 2.核酸序列测定及同源性分析证实,所构建的原核表达质粒pET-32a(+)-Der f 2中所含的Der f 2 cDNA片段与GenBank中的Der f 2序列同源性达到100%.Der f 2 cDNA在大肠埃希菌诱导表达后获得分子质量单位为34 ku的蛋白,蛋白含量占菌体蛋白含量的16%. 结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET-32a(+)-Der f 2,并在大肠埃希菌中获得高效表达,为获得重组纯化Der f 2变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础.

亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆和生物信息学分析

目的 从亚洲带绦虫(Taenia asiatica) 成虫cDNA 文库中克隆亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因(calcineurin B),并分析和预测其编码蛋白的结构和功能.方法 构建亚洲带绦虫成虫cDNA 质粒文库,从文库中识别钙调神经磷酸酶B基因并进行生物信息学分析和登录.结果 该基因登录号为ABN14963.1,是全长基因,长度747 bp,编码区为56～563,编码169个氨基酸;无跨膜区,蛋白的理化性质稳定;含有4 个"EF-hand"Ca2 + 结合区域;与GenBank中日本血吸虫同源基因的一致性达90%,相似性达95%;预测3个主要的抗原表位99～104、20～25、23～28在钙调神经磷酸酶B蛋白空间结构的分子表面.结论 应用生物信息学方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出一个钙调神经磷酸酶B基因.

灭蚊真菌-贵阳腐霉Pythium sp.GY1938菌株cDNA文库的构建及鉴定

目的 构建灭蚊真菌-贵阳腐霉Pythiumsp.GY1938菌株cDNA文库,为进一步筛选和克隆GY1938菌株特异表达基因奠定基础. 方法 以GY1938菌丝体为材料,液氮研磨法制备总RNA并分离纯化mRNA,应用SMAR-Ter技术将LD-PCR法合成并分级纯化的dscDNA连接至pSMART2IFD载体,电穿孔法转化至大肠埃希菌HST08,构建GY1938菌株cDNA文库,进行滴度、重组率和重组片段大小等文库质量检测. 结果 检测GY1938菌株cDNA文库滴度达1.36×106 cfu/ml,重组率为98％,插入片段长度约为300～2 500 bp. 结论 成功构建了较为理想的贵阳腐霉GY1938菌株cDNA文库,该文库可用于新基因的筛选、克隆和功能研究.

O型口蹄疫病毒O/LZ株基因组全长cDNA的构建

目的构建O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)O/LZ株基因组全长cDNA. 方法根据FMDV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点,将FMDV基因组设计为4段,进行反转录和扩增(RT-PCR),得到的片段分别克隆到质粒pMD18T-vetcor,筛选阳性重组质粒,测序正确的重组质粒(pMD18-S、pMD18-I、pMD18-P1和pMD18-P2)保存备用.然后对S区、I区和P2片段重新设计引物,其中S区的上游引物引入T7启动子序列;I区上游引物引入6个C,下游引物带有FMDV基因组中唯一酶切位点NruⅠ;用于3′端扩增的下游引物引入16个T,并以pMD18-S和pMD18-I为模板,对S区和I区进行融合PCR获得IS,以pMD18-P2为模板对P2片段进行2次PCR,获的带16个T的P3片段.将扩增片段克隆到pMD18T-vetcor,在pBuescript Ⅱ SK(-)中进行长片段的连接,获得基因组全长cDNA 克隆. 结果获得O型FMDV O/LZ株全基因组,并在此基础上构建了O/LZ株FMDV全长cDNA. 结论成功构建了O型FMDV O/LZ基因组全长cDNA 克隆,为进一步获得具有感染性的FMDV 分子克隆,并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础.

大鼠脑卒中相关基因的抑制性差减杂交文库构建

目的 建立寒冷加高盐刺激大鼠脑卒中的大脑组织差异cDNA文库。方法 正常Wistar大鼠随机分为寒冷加高盐刺激的实验组和不予任何处理的对照组。取实验组发生脑卒中和对照组的大脑组织。提取两组组织的mRNA，按照抑制性差减杂交试剂盒说明进行实验。在三个水平设定了检验差减效率的实验。首先是使用试剂盒提供的骨骼肌mRNA加入外源性PhiX174（HaeⅢ）作为阳性实验组与我们的实验样品进行平行差减，用来 证明系统正常。其次是采用PCR扩增看家基因GPDH的方法观察本次实验的差减效果。后在两库随机各挑取288个克隆测序，比较相同序列的重复情况。结果 差减各过程符合理论质量要求，分别得到一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。卒中库的理论容量是7.1×104，正常库的理论容量是5.5×105。差减效率分析表明 结果良好。结论 成功地建立了一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基 因片段库。为进一步深入研究该大鼠脑卒中模型的基因奠定了基础。

AIM To clone core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus ( HCV ) into eukaryotic expression vector cosmid pTM3 and to express HCV core antigen in HepG2 cells.METHODS Core gene cDNA of HCV was introduced into eukaryotic expression vector cosmid pTM3. Using vaccinia virus/bacteriophage T7 hybrid expression system,HepG2 cells were transfected with the recombinant plasmid pTM3-Q534 by lipofectin.RESULTS From the transfected bacteria Top10F′, 2 pTM3-Q534 clones containing the recombinant plasmid were identified from randomly selected 10 ampicillin-resistant colonies. By reverse transcription PCR and indirect immunofluorescence technique, HCV RNA and core protein was identified in HepG2 cells transfected with the recombinant plasmid.CONCLUSION The construction of a recombinant plasmid and the expression of core gene cDNA of HCV in HepG2 was successful.

大鼠中枢和外周神经损伤后胞体分布区神经组织基因表达谱的分析

目的:分析中枢和外周神经损伤后胞体分布区神经组织多基因表达谱的差异,探讨中枢和外周神经轴突损伤后再生差异的分子机制.方法:12只Wistar雄性大鼠随机分为右侧坐骨神经夹伤和胸段脊髓半横断两组.手术后7d,用cDNA Microarray技术检测1176个已知基因在与受损神经相应胞体分布区神经组织表达的变化,并分析其在中枢和外周神经损伤后表达的差异.结果:cDNA Microarray分析的数据显示,有74个基因在外周和中枢神经损伤后同时变化,其中29个基因变化趋势一致,12个基因表达上调,17个基因表达下调.呈反向变化的基因有45个.结论:中枢和外周神经轴突损伤后,多种结构、功能基因表达发生变化;外周和中枢神经损伤后多种结构、功能基因表达存在明显的差异.

绝经后妇女骨质疏松症肾阳虚证的关联蛋白 LTBP1的表达及其 cDNA 测序的研究

目的 探讨绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1蛋白表达及cDNA变化的关联性. 方法 随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阳虚证组27例,27例健康绝经后妇女为对照组,Western-blot法检测外周血LTBP1的蛋白表达,对cDNA片段进行测序. 结果 肾阳虚证组LTBP1蛋白表达水平(0.365 ±0.278)低于健康对照组(0.675 ±0.583)(P<0.05),差异有统计学意义. cDNA测序在健康对照组与肾阳虚证组中碱基无有意义的突变. 结论 绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1蛋白表达下调相关联,测序发现与碱基突变无关.

组织因子对SGC-7901 L2亚系胃癌细胞肝转移能力的影响

肝转移是影响胃癌预后的重要因素.Okano等[1]报道90例胃癌肝转移患者(同时性肝转移78例,异时性肝转移12例)中仅19例有条件行肝转移灶切除术,该19例患者1年和3年生存率分别为77%和34%.Hiratsuka等[2]报道胃癌肝转移患者中有40%合并腹膜转移,60%转移灶已累及肝左、右叶,仅10%有条件行B级治愈性切除术.本研究应用组织因子cDNA转染高转移能力的SGC-7901 L2亚系胃癌细胞,建它裸鼠原位种植肝转移动物模型,观察转染组织因子cDNA的SGC-7901 L2亚系细胞肝转移灶形成能力的变化,旨在探讨组织因子对胃癌细胞肝转移能力的影响.

+Gz重复暴露大鼠脑应激基因表达谱的cDNA微阵列研究

目的用cDNA微阵列技术研究+Gz重复暴露大鼠脑应激基因表达谱,探讨+Gz引起脑损伤的分子机制.方法 Wistar大鼠随机分成对照组和+Gz重复处理组,对照组大鼠G值为+1 Gz, 实验组大鼠在动物离心机上经历了3次+10 Gz/1 min(两次间隔30 min)作用,于暴露后6 h处死大鼠取脑.分别从+Gz处理组和对照组大鼠脑中提取总RNA,用α-32P dATP逆转录标记作为探针.将合成的2种cDNA探针分别与具有207个濡激基因的cDNA微阵列杂交,灰度扫描后分析两者表达谱差异.结果有15个应激基因在+Gz处理组表达升高.结论 +Gz重复暴露可引起脑组织中多个基因表达变化,这些基因的表达变化是脑损伤在基因水平上的表现,而cDAN微阵列是一种筛选差异表达基因的快速有效方法.

+Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库的构建

目的应用抑制性消减杂交技术构建+Gz重复暴露大鼠脑和正常大鼠脑差异表达的cDNA消减文库,为筛选+Gz暴露大鼠脑差异表达基因,探讨+Gz引起脑损伤的分子机制奠定基础.方法 Wister大鼠随机分成对照组和+Gz重复暴露组,对照组大鼠G值为+1 Gz, 实验组大鼠在动物离心机上经历了3次+10 Gz/1 min(两次间间隔30 min)作用,于暴露后6 h处死取脑.分别从+Gz重复暴露组和对照组大鼠脑中提取poly(A)+RNA,依次合成单链及双链cDNA,用RsaⅠ酶切成大小不等的片段.将+Gz重复暴露组cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与T/A载体连接构建+Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库.结果成功构建具有高消减效率的+Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库,非特异性cDNA片段被有效地消减,特异表达的cDNA得到富集.结论 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库的建立为进一步筛选、克隆+Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因奠定了基础.

降落PCR在运动人体科学实验检测中的应用

目的:探讨在运动人体科学实验中采用降落PCR (touchdown PCR,TD-PCR)方法同时扩增多个目的基因的应用.方法:对多个运动人体学科研究的相关mRNA进行逆转录,将逆转录后的cDNA采用TD-PCR法扩增,并与常规PCR方法结果进行比较.结果:TD-PCR方法可以同时扩增多个mRNA逆转录的cDNA,可以快速、有效扩增多个目的基因.

甘草HMGR基因cDNA的克隆及功能鉴定

甘草为常用中药材,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用.甘草酸是甘草中的主要活性成分,其生物合成途径受到许多酶的调控,其中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutary CoA,HMG-CoA)生成甲羟戊酸(MVA),是该途径中的第一个限速酶.本文克隆了甘草HMGR基因cDNA序列,对其进行序列分析,并与其他物种进行序列比对.构建了原核表达载体,诱导其外源表达及酶促反应,并利用TLC及GC-MS对产物进行检测.结果表明本文克隆得到的HMGR序列能很好的完成特定的酶促反应任务.由于HMGR基因在甘草酸生物合成途径中的重要作用,因此本实验的研究结果对于在分子水平上揭示高品质甘草的形成机制具有一定的意义.

中华大蟾蜍色氨酸羟化酶BbgTPH1基因的克隆、原核表达及功能鉴定

色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase Ⅰ,TPH1)是催化色氨酸生成5-羟色胺的限速酶,而5-羟色胺不仅是蟾酥的主要活性成分,同时也是中枢神经系统重要的神经递质,具有重要的生理功能.本研究从中华大蟾蜍耳后腺文库中克隆得到中华大蟾蜍色氨酸羟化酶cDNA.构建原核重组融合表达质粒pMAL-BbgTPH1,将其导入Escherichia coli TB1中,用IPTG诱导重组菌并优化诱导表达条件.以色氨酸为底物进行体外酶促反应,采用LC-MS法鉴定反应产物.结果显示BbgTPH1基因cDNA全长为1 984 bp,开放阅读框l 443 bp,编码480个氨基酸,推测蛋白质分子质量为55.2 kDa,理论等电点为5.58,具有芳香族类羟化酶超基因家族的保守结构域和芳香族类羟化酶家族特有的特征信号序列.氨基酸比对分析表明,该基因编码的氨基酸与其他物种TPH1蛋白序列具有较高的同源性.系统进化树显示BbgTPH1与非洲爪蟾的TPH1亲缘关系近.BbgTPH1在E.coli TB1中能够高效表达,其优化表达条件为诱导温度20℃、IPTG浓度0.5 mmol.L-1.酶活检测结果显示,重组BbgTPH1具有较高催化活性,可将色氨酸转化为5-羟色氨酸.本研究首次获得了蟾蜍属动物色氨酸羟化酶全长cDNA序列,并验证了其催化功能,为进一步研究蟾蜍中蟾毒色胺类化合物的生物合成分子机制以及次生代谢调控等提供了科学依据.

牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达

目的:开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽.方法:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)mRNA序列设计引物,用RT-PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAP cDNA,将其克隆入pUCm-T载体进行序列测定,将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究.结果:测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异,其中2个导致氨基酸替换;经微球菌溶解试验证明,注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA-tap能表达有活性的bTAP;抗体测定结果显示重组质粒pcDNA-tap经5次免疫后家兔产生的抗bTAP抗体效价达1∶800;经IPTG诱导后,含重组质粒pGEX-tap大肠杆菌能表达预计大小的GST-bTAP融合蛋白,且能被兔抗bTAP识别.结论:本研究克隆的bTAP cDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发.

云南个旧肺鳞癌YTMLC细胞cDNA文库构建和鉴定

目的构建云南个旧人肺鳞癌YTMLC-90细胞cDNA文库.方法从培养的人肺鳞癌YTMLC-90细胞株中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dT)引物(含SfiⅠB酶切位点)合成cDNA第一链,同时根据真核生物mRNA5'端帽子结构特点,利用SMART寡核苷酸(含SfiⅠ A酶切位点)作为cDNA第一链在mRNA 5'端延伸出去的模板,进而以此序列为引物,利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA,双链cDNA经Sfi Ⅰ(Ⅰ A和Ⅰ B)酶切和过柱分级分离后,克隆入经Sfi Ⅰ酶切的载体后经体外包装而成cDNA文库.结果人肺癌细胞YTMLC-90的cDNA文库获得1.01×106 pfu/ml个重组子,重组率为93.2%,文库扩增后,滴度达5.24×109pfu/ml,插入cDNA的长度为7.50～3000bp.结论所构建的cDNA文库具有较好的质量,该文库为进一步筛选、克隆肺癌特异表达基因莫定了基础.