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人7型腺病毒检测细胞系的构建与鉴定
目的 构建人7型腺病毒(human adenovirus type 7,HAdV7)检测细胞系.方法 将HAdV7中的Hexon基因克隆至带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)-Puro上,获得pLV-EGFP-hexon.将其与包装质粒p-Pax、pMD用脂质体Lip2000共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素压力筛选和系列的稀释法,获得HAdV7感染的检测细胞系HEp-2/GFP. 结果 细胞系HEp-2/GFP感染HAdV7后24 h,可观察到GFP的表达绿色荧光,而作为对照组的HEp-2/GFP细胞感染双链DNA病毒(如EB病毒和乙型肝炎病毒),并未观察到绿色荧光.此检测细胞系用不同滴度的HAdV7感染,至少可以检测到10 PFU/mL滴度的HAdV7.结论 成功构建了能检测HAdV7的细胞系HEp-2/GFP,且其检测的特异性和敏感性良好,可以作为检测HAdV7感染的诊断方法之一.
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081 利用微生物降解含汞废物的分子机制研究
由于含汞废物排放量大,对环境毒副作用强,因此近两年对含汞废物治理和回收的研究逐渐深入.随着分子生物学的发展,国内外学者都把目光投向利用微生物对含汞废物进行治理方面,尤其是对其抗性及重组体构建方面的研究进展较快.利用微生物在自然界形成的抗性,把各种抗性基因进行基因重组构建出耐毒性能更高的工程菌,可以把毒性大的含汞废物降解为毒性小、易回收的金属汞.鉴于此,本文对用来降解含汞废物的微生物的基因组成、抗性基因的转运机制、抗汞还原酶和裂解酶的作用机制等方面进行综述.
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160六价铬诱导P53蛋白活化的机制
本研究探讨了Cr(Ⅵ)诱导P53活化的机制.培养人肺上皮细胞系A549并进行传代.取3×105A549细胞转入一个6孔平皿,于37℃下温孵24h,立即转染1μg报告质粒和1μg β-半乳糖苷酶(β-Gal)质粒,温孵过夜后冲洗,加入含10%FBS的F-12K培养基,再培养24h后加入5、10、20、50和100μmol/L的Cr(Ⅵ)溶液处理(未经处理的为对照),然后加入400μl报道溶解缓冲液,在4℃下抽提细胞2h;取80μl细胞溶解产物测量虫荧光素酶和β-Gal活性,结果以β-Gal标化的相对P53活性(与对照相比)来表示.另取经Cr处理后的A549细胞,抽提细胞经声处理断裂DNA和减少粘度,然后取20μl全细胞溶解产物加热、离心,进行蛋白印迹分析(Westernblot).取细胞溶解产物、20μlRecin/TNT(1:10)和10μg抗体在4℃下温孵过夜并离心,取上清进行Western blot反应.
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脉冲场凝胶电泳与质粒图谱分析应用于浙江省甲副伤寒菌株的分子流行病学调查
目的应用分子生物学方法对浙江省甲副伤寒流行菌株的特征和分子分型进行研究.方法对浙江省26株暴发及散发甲副伤寒菌株作药敏试验、应用快速小量质粒提取方法并作图谱分析,同时应用脉冲场凝胶电泳分型技术(PFGE)分析比较暴发及散发菌株的基因图谱.结果26株菌株对SM、CAR耐药率高于52.00%,对COS、AMP高于84.00%,对SD高达100.00%.所有菌株含有-2.3Kb和-23.1Kb大小质粒.经XbaⅠ酶切,作PFGE分析发现各个菌株的染色体酶切图谱显示19～21条带,26株菌株共出现四种带型,所有菌株分析的条带数仅相差1～2条.结论浙江省甲副伤寒菌株普遍带有质粒且绝大数菌株具多重耐药性,这可能与浙江省甲副伤寒持续性高发有关.PFGE分析所有菌株均为同一克隆系,有一定相关性,说明浙江省流行的甲副伤寒菌株相对保守.
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淋病奈瑟菌青霉素、四环素耐药的分子检测
淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae,NG)的青霉素、四环素耐药表型研究(即药敏分析)国内已有较多文献报导.但不同的药敏检测方法其检出率的差异颇大.NG对青霉素、四环素耐药多数分别为获得TEM基因和Tet M基因的质粒所致.为精确了解常州地区NG对青霉素、四环素的耐药状况,我们应用以TEM基因为靶基因的套式聚合酶链反应(nested Polymerase Chain Reaction,nPCR)和以Tet M基因为靶基因的PCR技术对分离自常州地区的50株NG进行了分析检测,现将结果报告如下.
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引起老年患者院内下呼吸道感染的肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶基因型检测与分析
目的 探讨引起老年患者院内下呼吸道感染的肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶基因型,为产AmpC酶细菌的监测和防治提供依据.方法 采用头孢西丁纸片对产AmpC酶菌株进行初筛;双纸片表型确证法确证产AmpC酶;采用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取细菌质粒;采用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序检测分析质粒AmpC酶基因型.结果 双纸片表型确证试验检出17株产AmpC酶菌株,检出率为17.5％.经PCR扩增17株菌株均在405 bp处出现阳性条带,经DNA测序证实为DHA-1型质粒AmpC酶.结论 浙江省临海市中医院存在质粒介导AmpC酶流行菌株,质粒AmpC酶主要以DHA-1型为主.
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OXA-48的相关特性
苯唑西林酶OXA-48是一种D类碳青霉烯酶,近年来在肠杆菌科中报道日益增多.该酶对青霉素类水解能力很强,对碳青霉烯类药物活性较弱,酶活性不能被β-内酰胺酶抑制剂抑制.blaOXA-48基因上下游分别有一插入序列IS1999,共同组成转座子Tn1999.大多数菌株中,blaOXA-48基因位于一个可转移并且不携带其他耐药基因的62kb的质粒上,因此可以在细菌间广泛传播.PCR技术是检测菌株是否携带blaOXA-48基因的金标准.
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肠出血性大肠埃希菌O157:H7质粒PO157上毒力因子的研究进展
肠出血性大肠埃希菌O157∶H7是一种重要的致病菌,可以引起不同程度人类疾病.目前已知的O157∶H7的致病因子有3个,志贺毒素、粘附抹平效应毒力岛和特异性质粒pO157.其中pO157在致病过程中的作用并不十分清楚.本文结合近年来的研究进展,介绍了pO157上与细菌致病性有关的毒力因子.
关键词： 大肠埃希菌O157:H7 毒力因子 质粒 pO157 致病性 -
利用脉冲场凝胶电泳筛选质粒方法的建立和应用
目的 改良及优化常规脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)方法,建立基于PFGE技术筛选细菌质粒方法,并用于军团菌质粒的筛选.方法 使用含有质粒的杜莫氏军团菌及其质粒消除株对常规PFGE方法进行条件优化,调整细菌菌悬液浓度,蛋白酶K用量及作用时间,胶块清洗时间和次数,胶块不经过酶切直接进行PFGE,染色成像后选择能形成条带清晰脱尾较少的优条件.结果 去除常规PFGE方法中酶切步骤并优化裂解和清洗条件能使细菌DNA完整保留在胶块中,经过PFGE后,质粒DNA和染色体DNA在琼脂糖凝胶上能被很好的区分.结论 该方法较常规方法更为快速可靠,可用于细菌质粒图谱的快速筛选.
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肺炎克雷伯菌泛耐药株的质粒耐药元件研究
目的 通过对泛耐药肺炎克雷伯菌JM45的质粒1(pJM45-1)耐药元件分析,从基因组水平研究其泛耐药的遗传学基础.方法 采用第二代高通量测序技术平台进行全基因组测序,生物信息学方法分析pJM45-1质粒的耐药元件,并与已在NCBI登录的质粒序列作聚类分析(Fast Minimum Evolutin法).结果 pJM45-1质粒大小为317 156 bp,功能注释分析发现该质粒为可接合转移质粒,携带了抗菌药物耐药编码基因、重金属离子耐受编码基因、毒素编码基因和转座子以及插入序列等83个耐药相关编码基因.pJM45-1质粒与耐药质粒R100(登录号:AP000342.1)的全长94 281个序列中的45 995个序列有99％相同;与接合性质粒F质粒(登录号:AP001918.1)的全长99 159个序列中的8322个序列有87％相同.pJM45-1质粒与源自肺炎克雷伯菌的质粒在同一簇(cluster),与源自其他肠杆菌的质粒不在一个簇.结论 肺炎克雷伯菌JM45 pJM45-1质粒携带大量耐药元件,是该菌株进化为泛耐药的主要原因.pJM45-1是可接合转移质粒,可将耐药基因在细菌间进行水平转移,造成耐药菌的播散.
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质粒提取及酶切图谱鉴定
本实验是采取碱变性方法从重组大肠杆菌中提取质粒DNA,并用EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ两种限制性内切酶对质粒DNA进行适当酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳对DNA酶切图谱加以鉴定.通过在紫外灯下观察电泳结果,证实利用碱变性方法提取质粒,同时通过酚氯仿抽提,得到的质粒DNA纯度比较高.并且证实酶切图谱与预计相符.从而说明在一般工厂的实验条件下可以进行操作.
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表达型质粒载体pMG36e在宿主菌中的遗传稳定性研究
目的研究表达型质粒载体pMG36e在大肠杆菌JM109和乳酸乳球菌MG1363两种宿主菌中的遗传稳定性并观察红霉素对其稳定性的影响.方法按经典质粒遗传稳定性测定方法,在有选择压力(加红霉素)和无选择压力的条件下,测定pMG36e质粒在大肠杆菌JM109和乳酸乳球菌MG1363中的遗传稳定率.结果pMG36e质粒在大肠杆菌JM109中连续传至120代时,在有选择压力的条件下,质粒稳定率保持在100%;无选择压力的条件下为96%;pMG36e质粒在乳酸乳球菌MG1363中连续传至100代时,在有选择压力和无选择压力的条件下,质粒稳定率均为98%.结论pMG36e质粒在两种宿主菌中均具有较好的遗传稳定性.红霉素对pMG36e质粒的遗传稳定性无显著影响.
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MTB线粒体翻译控制28蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
对MTB线粒体翻译控制(mitochondrial translation control,MTC) 蛋白MTC28基因进行克隆, 构建真核表达质粒并在昆虫细胞中表达MTC28蛋白.采用PCR技术从MTB H37Rv 标准株基因组中扩增MTC28基因片断,MTC28基因片断和质粒pFastbac1经EcoRI和XhoI双酶切,T4 DNH连接酶连接,构建重组质粒pFastbac1-MTC28,转染DH5α感受态细菌,在含有氨苄青霉素溶菌肉汤(lysogeny broth,LB)固体培养基中筛选阳性克隆,挑选生长的菌落进而在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行细菌克隆.PCR鉴定目的基因插入质粒后,阳性克隆细菌进行质粒(pFastbac1-MTC28)的提取.pFastbac1-MTC28质粒转染DH10 Bac感受态细菌构建重组杆状质粒(Bacmid-MTC28),用含有庆大霉素、卡那霉素和四环素的液体LB培养基进行细菌克隆,采取蓝白斑技术筛选阳性菌落.PCR鉴定为阳性的细菌进行杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)的提取.利用脂质介导的转染技术,将杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)转染sf9昆虫细胞中,包装重组杆状病毒,并表达蛋白质.结果成功构建了MTC28真核表达质粒,建立了杆状病毒表达MTC28蛋白的表达体系,并表达MTC28蛋白,通过纯化获得了高纯度且均一化的MTC28蛋白.
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整合子介导的沙门菌耐药性水平播散机制的初步研究
目的 分析南通地区沙门菌的耐药性,初步阐明定位于质粒上的整合子介导的耐药性传播的分子机制.方法 收集2008-2011年南通地区食品中分离的沙门菌67株,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,确定其耐药谱；筛选出多重耐药性菌株,并以大肠杆菌为受体菌进行接合试验.PCR分析受体菌整合子特异序列,并进行分型检测.结果 南通地区检测出的沙门菌中有74.6％的沙门菌株(50/67)对抗生素产生耐药性,其中31.3％ (21/67)对超过1种抗生素有耐药性,发展成为多重耐药性沙门菌；沙门菌Ⅰ类整合子检出率为20.9％(14/67).结合实验还发现沙门菌Ⅰ类整合子可以介导耐药性向大肠杆菌的传播.结论 南通地区食品分离的沙门菌Ⅰ类整合子检出率较高.沙门菌携带的Ⅰ类整合子是引起耐药性在种间和种内传播的重要因素.
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肠出血性大肠埃希菌O157:H7基因组和质粒pO157致病因子
为推动O157:H7致病机制的深入研究,介绍了近年来对EHEC O157:H7的基因组和特异性大质粒pO157上与细菌致病性有关的主要致病因子的研究进展.
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亚甲蓝/光化学法对细菌DNA的损伤作用研究
目的 研究亚甲蓝/光化学方法灭活血液中病毒的作用机理.方法 用琼脂糖凝胶电泳、质粒转化实验和RAPD扩增技术,对亚甲蓝/光化学处理大肠杆菌质粒DNA的损伤作用进行观察.结果 含亚甲蓝浓度为1 μmol/L～20 μmol/L的质粒DNA,经亚甲蓝/光化学处理后琼脂糖凝胶电泳可观察到质粒DNA的断裂;转化实验结果发现经过化学方法处理的质粒随着处理时间延长和亚甲蓝浓度的提高其转化子总数显著减少;RAPD扩增结果发现随着处理时间的延长RAPD扩增条带逐渐消失.结论 亚甲蓝/光化学法可同时在多个位点对DNA有损伤作用.
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大肠杆菌O157:H7对消毒剂抗力与质粒pO157关系的研究
用高温-SDS法消除大肠杆菌O157:H7的质粒pO157,并将质粒pO157转化到大肠杆菌JM109,对比质粒pO157消除和转化前后试验菌对4种消毒剂的抵抗力.结果,质粒pO157消除后,试验菌对季铵盐的抵抗力有明显降低,对碘伏的抵抗力有明显的增强,对二氯异氰尿酸钠、醋酸氯己定的抵抗力无变化;将pO157转化到大肠杆菌JM109后,阳性转化菌对4种消毒剂的抵抗力均有不同程度增强,其中对季铵盐的抵抗力增加近60倍.结果提示,质粒pO157上可能带有抵抗季铵盐的基因而未携带抗碘伏的基因;消除质粒pO157后的试验菌对碘伏的抗性增加却说明pO157与试验菌对碘伏的抵抗力有间接关系.
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鲍曼不动杆菌耐消毒剂-磺胺基因qacE△1-sulI的研究
目的 研究临床分离鲍曼不动杆菌耐消毒剂qacE△1-sulI携带情况,探讨其传播机理.方法 采用聚合酶链反应(PCR)分析方法,对某医院临床分离鲍曼不动杆菌携带qacE△1-sulI基因状况进行分析.结果 从临床分离的92株鲍曼不动杆菌中,检出84株质粒上携带qacE△1-sulI基因,阳性率为91.3％.质粒接合实验结果显示,84株耐消毒剂基因阳性菌株中,有56株菌质粒为可接合质粒,其质粒均存在qacE△1-sulI基因.结论 临床分离的鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因携带率高,其质粒上携带可接合传递的qacE△1-sulI基因,提示耐消毒剂基因可通过质粒传播.
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消毒液中污染的凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因定位研究
对分离自使用中消毒液的29株CNS,进行了质粒消除前后的耐药性研究.结果,消除质粒前,29株CNS耐药重数为138,消除质粒后减至25,即由质粒介导的耐药性占81.9%(113/138),由染色体编码者占18.1%(25/l 38).结果显示同一质粒可同时携带多个耐药基因.表明质粒介导在CNS耐药中起主要作用.
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致腹泻奇异变形杆菌病原学及其分子特征研究
目的：研究致腹泻奇异变形杆菌病原学特征及毒力基因和质粒携带情况，探讨其与耐药性/致病性的关系。方法对6株不同来源（食物中毒、外环境及健康人群）的奇异变形杆菌进行生化、药敏和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析；PCR检测常见的毒力基因；提取质粒后电泳并切胶回收质粒进行测序分析。结果不同来源的奇异变形杆菌生化特征基本相同，且均具有常见的毒力基因ureC、rsmA、hpmA和zapA。但各菌株PFGE分型和药敏结果不同，其携带质粒情况也各异。对其中2株菌存在的小质粒测序后发现，该质粒长2683 bp，主要编码qnrD基因，与耐喹诺酮类药物相关。结论采用传统的生化分析及常见的毒力基因鉴定方法，无法区分不同来源的奇异变形杆菌，可利用PFGE和质粒分析。耐药菌株中普遍存在的质粒与菌株的耐药性相关，存在多个质粒的菌株其耐药性更强。
