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深圳市某福利院一起急性结膜炎疫情的病原学分析
目的 鉴定深圳市某福利院一起急性结膜炎疫情的病原体.方法 采用荧光定量PCR方法对12份眼拭子标本进行检测以确定病原,阳性标本进行病毒分离培养,扩增特异基因并测序,对序列进行进化分析和分子分型.结果 12份标本荧光定量PCR检测结果为人腺病毒阳性,分离9株病毒.人腺病毒Hexon基因测序显示9株腺病毒之间核苷酸相似性在98.3％-100％之间,系统进化分析显示9株腺病毒与人腺病毒7型参考株位于同一进化分支.结论 本起疫情由人腺病毒7型引起,与我国近期流行的腺病毒7型同源.
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1例人感染腺病毒55型病原体的分离鉴定及进化分析
目的 对1例人感染腺病毒55型病原体进行分离鉴定及进化分析.方法 选取2015年5月安庆市某流感监测哨点医院采集的一例被诊断为急性上呼吸道感染患者的咽拭子标本作为研究样本,提取标本总核酸,采用人腺病毒通用引物进行real-time荧光定量PCR检测.将检出的阳性标本感染Hep-2细胞进行病毒分离.对成功分离的腺病毒毒株进行六邻体基因的扩增、 纯化并测序.测序结果提交GeneBank上Blast,同源分析确定型别、制作系统进化树以及分析六邻体基因和氨基酸序列. 结果 对咽拭子标本中的病毒核酸进行荧光定量PCR 检测,结果显示,腺病毒核酸DNA检测呈阳性(Ct<24).同源比对结果显示,该株的六邻体(Hexon)基因与辽宁株、江苏株、河北株、山西株、安庆株(GenBank号分别为KP896483、KX289874、KP896478、FJ643676、KP279748)的同源性可达100%,与安徽株(KC551973)可达99.96%,存在一个核苷酸C→T的无义突变.进一步的分析显示,该株与参考株在系统发生树上处于同一进化分支,Hexon蛋白氨基酸的同源性为100%. 结论 此ADR标本由人腺病毒55型感染引起,其Hexon蛋白氨基酸没有出现变异.
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人7型腺病毒检测细胞系的构建与鉴定
目的 构建人7型腺病毒(human adenovirus type 7,HAdV7)检测细胞系.方法 将HAdV7中的Hexon基因克隆至带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)-Puro上,获得pLV-EGFP-hexon.将其与包装质粒p-Pax、pMD用脂质体Lip2000共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素压力筛选和系列的稀释法,获得HAdV7感染的检测细胞系HEp-2/GFP. 结果 细胞系HEp-2/GFP感染HAdV7后24 h,可观察到GFP的表达绿色荧光,而作为对照组的HEp-2/GFP细胞感染双链DNA病毒(如EB病毒和乙型肝炎病毒),并未观察到绿色荧光.此检测细胞系用不同滴度的HAdV7感染,至少可以检测到10 PFU/mL滴度的HAdV7.结论 成功构建了能检测HAdV7的细胞系HEp-2/GFP,且其检测的特异性和敏感性良好,可以作为检测HAdV7感染的诊断方法之一.
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一起人7型腺病毒引起的幼儿园聚集性疫情调查
目的 分析江西省某幼儿园呼吸道感染聚集性疫情的流行病学特点、病例临床特征及病原学特点,探寻疫情发生原因,为此类疫情的防控提供经验.方法 通过询问幼儿园园长和各班级老师,以及调阅医疗机构的病例信息等方式搜索病例.应用流行病学调查表收集病例的基本信息、临床症状、发病经过,以及流行病学史等内容.使用荧光定量PCR仪对采集的病例标本进行病毒核酸检测,并对阳性标本进行病毒分离,使用基因分析仪对扩增产物进行测序,同时采用高通量测序技术获得病毒全基因组序列.结果 本次疫情发病32例,均为学生,发病率为15.69％(32/204);90.6％(29/32)的病例集中在4月27日至5月4日发病,主要表现为高热、干咳,并伴有肺部炎性改变;病例中年龄大的6岁,小的2岁,发病年龄集中在3～5岁,占病例总数的90.6％(29/32).大(1)班发病率较高,为17.7％(6/34),学前班发病率较低,为9.4％ (3/32),差异无统计学意义(x2=2.79,P=0.74);男性发病率为17.82％(18/101),女性为13.59％(14/103),差异无统计学意义(x=0.69,P=0.45);一楼学生发病率为13.08％(14/107),二楼为18.56％(18/9),差异无统计学意义(x2=1.15,P=0.34).通过病毒核酸检测和全基因组序列测定在病例标本中检出H7型腺病毒.结论 本次疫情是由人H7型腺病毒引起的聚集性疫情,主要通过密切接触和呼吸道飞沫传播.幼儿园通风条件差、晨午检等制度不健全,是造成疾病蔓延的主要原因.
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人腺病毒的研究进展
人腺病毒(Human adenovirus,HAdV)是引起婴幼儿急性呼吸道感染等多种疾病的重要病原体之一,本文回顾了有关HAdV的分子生物学特征、检测方法及分型、致病机制、相关疾病的临床特征、流行病学特征、HAdV感染的预防和控制研究的文献.迄今为止明确的HAdV有67种不同型别,包括近几年发现的重组变异株.导致急性呼吸道感染的主要流行株为HAdV-3和HAdV-7,属于B亚组,也可以引起其他系统的疾病,所致疾病的临床表现与其他呼吸道病毒相关病毒相似,但多伴消化道症状,其致病机制尚不清楚.对于新发现的变异重组株,其与疾病的相关性研究甚少,需要进一步研究证实.由于没有前瞻性的、大样本的随机对照治疗试验,HAdV感染的治疗目前存在争议.疫苗是降低呼吸道HAdV感染有效的措施,但还没有上市的产品.
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西安市流感样病例中人腺病毒感染特点分析
目的 分析2013-2015年西安市流感样病例中非流感患者腺病毒(HAdV)感染的流行病学特点和病毒分型特征.方法 收集2013年1月到2015年12月西安市两所国家级流感监测哨点医院的流感样病例样本,经荧光PCR筛检流感病毒阴性而腺病毒阳性的标本,进行病毒分离后对HAdV六邻体(Hexon)基因扩增、测序及分型鉴定,与HAdV 1-7型的参考序列构建基因进化树.结果 2 367份标本中检测出88例腺病毒阳性,阳性率为3.72％.共检出7种亚型的HAdV,其中HAdV-1型占9.09％,HAdV-2型占22.73％,HAdV-3型占23.86％,HAdV-4型占5.68％,HAdV-5型占7.95％,HAdV-6型占3.41％,HAdV-7型占1.14％.在腺病毒阳性病例中,男性检出率高于女性,但差异不具有统计学意义(P＞0.05);按年龄分6个组,1岁以下3例阳性,1～3岁36例阳性,4～6岁26例阳性,7 ～18岁16例阳性,19 ～59岁5例阳性,60以上2例阳性.7岁以下儿童高发,年龄组间差异具有统计学意义(x2=0.10,P ＜0.05).结论 2013-2015年西安市上呼吸道感染中HAdV的主要的流行型别为3型和2型,7岁以下儿童高发;HAdV的感染全年散发,无明显季节性.
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上海市重症急性呼吸道感染儿童中可检出多种型别的人腺病毒
目的：了解上海市重症急性呼吸道感染（ SARI）儿童中人腺病毒（ HAdV）的感染情况及其分型特征。方法2013年6月至2014年3月从上海复旦大学附属儿科医院收集441份重症急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物（ NPAs）。采用巢式PCR的方法进行人腺病毒的检测，对阳性样本进行分型分析及基本流行病学特征分析。结果人腺病毒共检出51例（11.6％，95％CI 8.6％～14.6％）阳性，以0.5～1岁之间的患儿感染率较高，分型分析发现感染者中B组所占比例高，共33例（64.7％），其中HAdV-3共17例（33.3％），HAdV-7共检出16例（31.4％）；其次为C组共14例（27.5％）；HAdV-D （HAdV-8）与 HAdV-E（HAdV-4）各1例；HAdV-F（HAdV-41）检出2例。结论人腺病毒在上海市重症急性呼吸道感染患儿中有较高的感染率，存在多种基因型且以HAdV-B中的HAdV-3、7型感染为常见。
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2011-2013年无锡地区人腺病毒流行特征与分型
目的 了解2011-2013年无锡地区人腺病毒的流行的基因型及规律.方法 对2011-2013年无锡市人民医院送检的1 893份急性呼吸道感染标本,用Real-time PCR方法扩增腺病毒基因,检出的阳性标本接种Hep-2细胞分离病毒,然后对其扩增产物进行纯化和测序比对,所得基因序列用Bioedit和MEGA 5.0进行进化树分析.结果 2011-2013年无锡地区人腺病毒全年都有出现,多发生在冬春季,1-3岁的儿童检出率(44.26％)高,型别主要有B亚群的HAdV-3型4株(1 3.33％)、HAdV-7型6株(20.00％)和C亚群HAdV-1型5株(16.66％)、HAdV-2型8株(26.67％)、HAdV-5型3株(10.00％)、HAdV-6型4株(13.33％).基因进化树形成2个独立的分支,C亚群逐渐成为优势株.结论 2011-2013年无锡地区人腺病毒有明显的季节性,多发生在冬春季,1-3岁的儿童是主要的易感人群.B和C两种亚群6个血清型为优势流行株,推测有B亚群向C亚群转变的流行趋势.
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我国呼吸道感染人腺病毒的基因型流行概况
人腺病毒(human adenoviruses,HAdVs)是一种无包膜的双链DNA病毒,可分为A～G共7组,80多种血清型或基因型,感染呼吸道的主要为HAdV-B,HAdV-C和HAdV-E组HAdVs,是呼吸道感染的重要病原之一.我国地域辽阔,不同地区流行的HAdVs优势基因型不同.本文对我国呼吸道感染HAdVs的基因型流行概况进行了综述,总结和分析了我国不同地区的HAdVs优势流行型别和新型HAdVs的流行概况.
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腺病毒编码人TRP2修饰DC诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的研究
目的比较腺病毒载体(Ad)介导人和小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2,TRP2)修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DC)诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的差异.方法Ad编码人或小鼠TRP2(Ad hTRP2或Ad mTRP2)体外感染小鼠BM-DC并体内皮下免疫C57BL/6小鼠,7 d后取出被免疫小鼠脾细胞行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤试验(in vivo CTL)和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析CTL的杀伤活性和IFN-γ的产生;或给免疫后小鼠皮下接种小鼠B16.F10黑色素瘤细胞,观察荷瘤小鼠的成活情况.结果in vivo CTL和ICS分析显示,Ad hTRP2/BM-DC免疫小鼠,其6 h CTL杀伤率为(98.7±1.2)%,IFN-γ产生的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的(1.25±0.21)%;而AdmTRP2/BM-DC免疫的小鼠,其6 h CTL杀伤率和产生IFN-γ的CD8+T细胞比例分别为(28.6±6.3)%和(0.24±0.06)%.荷瘤试验表明,Ad hTRP2/BM-DC免疫小鼠后1周皮下接种106 B16.F10细胞,观察3个月100%的小鼠无瘤生长;而接种5×104 B16.F10细胞至Ad mTRP2/BM-DC免疫1周的小鼠,3个月后小鼠成活率仅为40%.结论Ad介导异种(人)TRP2较自身(小鼠)TRP2修饰的BM-DC更为有效地打破肿瘤免疫耐受、诱导强烈的抗黑色素瘤免疫反应,是一种高效的以DC为基础的肿瘤疫苗.
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人腺病毒感染的免疫应答机制
人腺病毒(Human adenovirus,HAdV)是基因药物中使用广泛的载体,其应用范围从溶瘤治疗到疫苗接种,也是引起婴幼儿急性呼吸道感染等多种疾病的重要病原体之一.人类先天性免疫系统如何防御HAdV一直是其作为疫苗载体应用的研究重点,在免疫缺陷患者及造血干细胞移植患者中,特异性T细胞免疫治疗也是近年研究的热点之一.虽然部分HAdV载体疫苗已进入临床试验,其免疫机制仍存在争议.本文描述了人体先天性免疫系统和适应性免疫系统是如何防御HAdV,及HAdV对人免疫应答的逃脱机制,以期为疫苗研究指明方向,深化临床医师对HAdV重症感染的认识.
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儿童社区获得性肺炎中人腺病毒感染的多中心研究
目的 了解我国儿童社区获得性肺炎(CAP)中人腺病毒(HAdV)的优势基因型别和流行特征.方法 横断面研究,采集2014年11月-2016年11月我国北方和南方12家医院临床诊断为CAP的住院患儿鼻咽抽吸物(NPAs)或咽拭子1份,应用Luminex公司的液相悬浮芯片技术筛查包括HAdV在内的18种常见呼吸道病毒.对HAdV阳性标本进行基因分型及基本流行病学及临床特征分析.结果 (1)本研究共纳入2 723例CAP患儿,检测出HAdV阳性标本156例(5.7％,156/2 723),其中北方74例(6.6％,74/1 128),南方82例(5.1％,82/1 595),南北方阳性检出率差异无统计学意义(P＞0.05).(2)我国北方＜6月龄组、6月龄～＜1岁年龄组、1～＜3岁年龄组、3～＜5岁年龄组和≥5岁年龄组的HAdV检出率分别为5.9％(6/101),6.7％(7/104),10.3％(34/331),4.1％(11/266)和4.9％(16/326),1～3岁年龄组HAdV检出率高(x2=11.511,P=0.021);南方＜6月龄组、6月龄～＜1岁年龄组、1～＜3岁年龄组、3～＜5岁年龄组和≥5岁年龄组的HAdV检出率分别为2.2％(7/312),4.6％(12/259),6.3％(31/494),7.3％(18/245)和4.9％(14/285),各年龄组差异无统计学意义(P＞0.05).(3)2015年我国北方冬季HAdV检出率高为12.5％ (25/200),南方地区在春季和夏季HAdV检出率高,分别为春季6.7％(35/525),夏季5.3％ (19/357).(4)对108例HAdV阳性标本进行分型,分型成功80例,其中3型32例,7型9例,1型12例,2型15例,5型10例,6型1例,4型1例.我国北方地区流行的优势型别为HAdV-B组HAdV-3 (30.8％,8/26)和HAdV-7 (26.9％,7/26),而南方地区流行的优势型别为HAdV-B组HAdV-3 (44.4％,24/54)和HAdV-C组HAdV-2(22.2％,12/54).结论 HAdV是儿童CAP的重要病毒病原,北方和南方流行的优势型别和感染高发季节存在差异,北方地区流行的优势型别为HAdV-3和HAdV-7,南方地区流行的优势型别为HAdV-3和HAdV-2,北方地区冬季为HAdV感染的高发季节,南方地区春季和夏季为HAdV感染的高发季节.
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实时荧光定量PCR快速检测腺病毒方法的建立与评价
目的 建立针对人腺病毒Hexon基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,用于腺病毒感染的早期诊断及病毒核酸定量分析.方法 根据人腺病毒Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,建立人腺病毒实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法.对方法的灵敏度及特异性进行评价;选取3个浓度的标准品,进行5次重复检测,对方法的重复性进行验证;用该方法对90份临床标本进行检测.结果 建立的检测方法对人腺病毒的检测与其它呼吸道病原无交叉反应;检测灵敏度为10拷贝/μl;对103、104、105拷贝/μl 3个浓度标准品分别进行5次重复检测,其Ct值的变异系数均小于5％.对临床90份发热病例的咽拭子标本检测的腺病毒阳性率为90％,与普通PCR检测法的结果(90％)一致;检测准确率达100％.结论 本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度和重复性均好,适用于人腺病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断.
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腺病毒抗原表位嵌合蛋白的原核表达及其免疫原性
目的 设计含有人腺病毒(human adenovirus,HAdV)3、7、11、14及55型抗原表位的嵌合蛋白,利用大肠埃希菌进行原核表达,并检测其抗原性及免疫原性.方法 对5种型别HAdV的六邻体蛋白氨基酸序列进行分析,筛选出其中具有强抗原性的片段,片段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸进行连接,形成1个多抗原片段串联的嵌合蛋白.优化嵌合蛋白的基因序列并化学合成全长基因,克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),筛选高表达嵌合蛋白的工程菌.用High Affinity Ni-NTA resin纯化该嵌合蛋白,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,间接ELISA法检测嵌合蛋白的抗原性及免疫原性.结果 成功构建了高表达嵌合蛋白的工程菌,表达的嵌合蛋白相对分子质量约55 000,表达量达95％;破菌上清中嵌合蛋白的纯度较高,纯化后纯度在90％以上.嵌合蛋白免疫小鼠4次后,小鼠抗血清效价达1∶320 000.制备的腺病毒抗原表位嵌合蛋白能有效检测血清中腺病毒3、7、1 1、14及55型抗体,且能有效刺激机体产生针对各型别腺病毒抗原表位的抗体.结论 表达制备的包含5种型别HAdV抗原表位的嵌合蛋白具有较好的抗原性及免疫原性,为进一步研制腺病毒疫苗、单克隆抗体及诊断试剂奠定了基础.
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人腺病毒六邻体蛋白保守区抗原性分析
目的 阐明人腺病毒(HAdV)六邻体蛋白保守区的抗原性的特征,为鉴定六邻体的抗原表位奠定基础.方法 用生物信息学软件ANTHEPROT 5.0和DNAMAN对HAdV3六邻体氨基酸序列进行抗原性预测分析和二级结构的分析,然后由SWISS-MODEL Protein Modelling Server预测出HAdV3六邻体蛋白三维结构.结果 抗原性预测分析显示,在六邻体的前段和中段,该区域含有大量的保守区,可能具有较强的抗原性,而六邻体后段总体抗原性较弱.根据HAdV2六邻体蛋白三维结构模型预测出HAdV3六邻体蛋白三维结构.结论 六邻体的前段和中段的部分保守区域在腺病毒颗粒上可能具有较好的暴露性并可能含有抗原性较强的型间或组特异性抗原表位.
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人腺病毒3型感染对H9c2细胞microRNA表达谱的影响
目的 研究腺病毒感染对大鼠心肌来源的H9c2细胞microRNA表达谱的影响.方法 用人腺病毒3型(Ad3)攻击成层和未成层的H9c2细胞,6 h后收获总RNA,基因芯片检测microRNA表达谱.结果 比较未成层与成层的H9c2细胞microRNh的表达谱,H9c2细胞成层后有54种microRNA表达显著下调,7种microRNA表达显著上调.与未感染病毒的细胞比较,Ad3感染的未成层H9c2细胞有41种microRNA表达显著下调,12种microRNA表达显著上调.与未感染病毒的细胞比较,Ad3感染成层H9c2细胞后有8种microRNA的表达显著下调.62种microRNA的表达显著上调.结论 细胞不同的生长状态及Ad3感染显著改变了H9c2细胞的microRNA表达谱.
关键词： 人腺病毒 H9c2细胞 microRNA芯片 心肌炎 -
中缅树鼩自然感染五种高致病性人腺病毒的血清流行病学分析
目的 分析中缅树鼩(Tupaiabelangeri,Tree Shrew)自然感染 5 种高致病性人腺病毒(Human Adenovirus, HAdv)的血清流行病学,以探讨人腺病毒感染树鼩的可能性.方法 采用固定病毒稀释血清法测定34份树鼩血清对 Ad3、Ad4、Ad7、Ad14和 Ad55的中和抗体水平.结果 4种B组腺病毒的中和抗体阳性率及中和效价较 E组4型的大,阳性率由大到小依次为:Ad14(55.88%)、Ad3(47.06%)、Ad55(29.71%)、Ad7(14.71%)、Ad4(8.82%),树鼩血清主要表现为 Ad3、Ad14和 Ad55混合型多价抗血清.结论 中缅树鼩可自然感染5种人腺病毒,有望以树鼩为实验动物,建立一种成熟的人腺病毒感染模型.
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一起腺病毒引起的聚集性呼吸道感染的实验室调查
目的 对一起幼儿园聚集性发热事件开展病原学调查,为疫情处置提供依据.方法 采集部分患者呼吸道样品,应用real-time RT-PCR法筛查,腺病毒核酸阳性样品接种HEp-2细胞系,PCR扩增部分腺病毒Hexon高变区基因片段并测序,确定病毒型别并进行变异分析.结果 从10份咽拭子标本中检测到7份腺病毒核酸阳性.经分离培养得到7株人腺病毒毒株.系统进化分析确定均为人腺病毒7型.推导的氨基酸序列分析显示,与近年来国内外流行株相比,分离株的Hexon蛋白高变区无氨基酸位点突变.结论 结合病例临床表现以及流行病学调查结果,此事件证实系人腺病毒7型引起的急性呼吸道感染聚集性事件.
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北京地区2015年11月-12月流感样病例中人腺病毒的感染情况分析
目的 了解北京地区2015年11月-12月流感样病例中人腺病毒感染情况及型别分布特征,为北京地区呼吸道病毒传染病防控策略的制定提供依据.方法 选取2015年11月-12月的874份流感样病例,收集病例的临床资料,采集咽拭子样本,采用实时荧光PCR法,进行人腺病毒核酸筛查.核酸阳性的标本进行病毒的分离培养.之后对培养物提取核酸,进行hexon基因扩增,对扩增产物测序和序列比对;采用MEGA 5.0软件进行基因进化树构建和分析.结果 874份样本中,共检出人腺病毒核酸阳性19份,阳性率为2.17％ (19/874);15岁以下患者阳性检出率高,为4.15％(13/313).男、女病毒检出率差异无统计学意义(Z=1.360,P＞0.05).成功分离到18株人腺病毒,序列比对和进化分析结果显示,人腺病毒基因型别分布为C组HAdV-1(3/18,16.67％)、HAdV-2(3/18,16.67％)、B组HAdV-3型(12/18,66.67％).结论 调查期间北京地区流感样病例中有3种型别的人腺病毒流行,主要流行为HAdV-3型.人腺病毒感染病例主要分布于15岁以下人群.
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人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立
目的 通过建立人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法,快速鉴定人3型腺病毒感染,为早期诊断提供依据.方法 以人3型腺病毒感染的细胞和常见的呼吸道消化道感染的病原体为研究对象,根据病毒六邻体高度保守的序列,设计荧光定量PCR反应体系,并分析实验的敏感性和特异性.结果 人3型腺病毒TCID_(50)细胞培养液中病毒核酸低检出稀释度是10~(-6),对应的拷贝数分别是5.802x10~3 copies/mL和6.968x10~2copies/mL,呼吸道和消化道感染常见的病原体未出现交叉反应.结论 荧光定量PCR的应用,可有效缩短检测时间,提高检测的敏感度.
