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人参水提物对H2O2损伤的H9c2细胞的保护作用研究
目的:研究人参水提物对H2O2损伤的H9c2心肌细胞的保护作用.方法:以100μ mol/LH2O2诱导H9c2心肌细胞建立氧化应激损伤模型,人参水提物在建模前12h加入,共培养24h后,分别用MTT法检测细胞增殖活力,通过比色法、WST-l法和TBA法分别检测培养液上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量.结果:H2O2处理后,细胞存活力降低为原来的48.7％,当生药浓度为0.1mg/mL时人参水提物能使得细胞得到保护,LDH漏出量降低至19.3％,MDA含量降低了23.1％;当生药浓度＞1.0mg/mL时,与模型组比较,加药组使得细胞活力提高1.5倍以上,LDH漏出量多降低98％,同时细胞内的SOD活性多升高为模型组的2倍以上,MDA含量多降低61.5％(P＜0.05,P＜0.01).结论:人参水提物对H2O2损伤的H9c2心肌细胞具有保护作用,有望开发为人参生物活性评价的方法之一.
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人参皂苷Rb1减轻阿霉素诱导心肌细胞自噬的保护作用
该研究以H9c2细胞为研究对象,采用阿霉素诱导心肌细胞自噬活化,探讨人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌细胞自噬的作用.应用CCK-8法、透射电镜观察、荧光染色观察、Western blot等方法分别检测药物作用后H9c2细胞的增殖以及自噬变化.结果显示,阿霉素引起H9c2细胞活力下降,导致H9c2细胞的自噬相关结构增加、自噬标志性蛋白LC3由LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ增加及p62蛋白表达降低;人参皂苷Rb1可以减弱阿霉素引起的心肌细胞活力下降并抑制阿霉素诱导的自噬相关结构增加、LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ的增加以及p62蛋白表达的降低.以上结果提示,阿霉素可引起H9c2细胞死亡并诱导细胞自噬的活化,而人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌细胞死亡具有保护作用,这种作用可能是通过调节自噬产生的.
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基于中药血清化学及血清药理学方法探讨香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤物质基础
目的:利用中药血清化学及血清药理学方法探讨香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的物质基础.方法:测定和比较香青兰提取物及其灌胃给药前后大鼠空白血清和含药血清的HPLC,寻找香青兰入血成分；体外培养乳大鼠原代心肌细胞及H9c2细胞,用Na2S2O4或N2为缺氧剂建立缺氧/复氧损伤模型,以细胞活力、LDH释放量、T-SOD活力、MDA产量及细胞凋亡为指标,考察香青兰提取物及其含药血清、香青兰提取物不同给药剂量及不同给药时间段所采血清的处理物对细胞损伤的影响.结果:香青兰在血清中出现4个移行成分,其中3个为原型成分,1个可能为代谢产物；与模型组或空白血清组相比,香青兰提取物、含药血清及不同因素影响下的血清处理物显著降低缺氧/复氧心肌细胞LDH释放量和MDA产量(P＜0.05,P＜0.01),显著升高T-SOD及细胞活力(P＜0.05,P＜0.01),明显抑制细胞凋亡.结论:香青兰提取物4个入血成分可能为香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的物质基础.
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核糖核酸干扰技术沉默大鼠心肌细胞核因子-κB p65表达的研究
目的:构建核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB) p65亚基特异的核糖核酸干扰腺病毒表达载体,验证其对p65亚基的沉默效应.方法:设计针对大鼠NF-κB p65亚基的不同干扰序列,通过质粒将其导入腺病毒,感染大鼠心肌细胞(H9C2).将感染后的心肌细胞通过RT-PCR方法和Western Blot方法检测各组NF-κB p65的基因水平表达和蛋白质水平表达.结果:成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染H9C2细胞后可以高效抑制NF-κBp65蛋白的表达.结论:RNAi技术能有效的沉默大鼠心肌细胞NF-κB p65的表达.
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厄贝沙坦通过核转录因子kB信号通路减轻高糖诱导的H9C2细胞炎症反应及凋亡的研究
目的 探讨厄贝沙坦通过抑制核转录因子kB(NF-kB)的表达减轻高糖诱导的H9C2细胞炎症反应及凋亡. 方法 将H9C2细胞分为:对照(Con)组(5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇(Man)组(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇)、二甲基亚砜(DMSO)组(5.5 mmol/L葡萄糖+1‰二甲基亚砜)、高糖(HG)组(33 mmol/L葡萄糖)、厄贝沙坦(Ir)组(33 mmol/L葡萄糖+1 μmol/L厄贝沙坦),每组3个细胞.检测细胞增殖抑制率;IL-6、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、TNF-α、Bax、Bcl-2 mRNA;核转录因子kB(NF-kB)、caspase-3蛋白表达及细胞凋亡率. 结果 Ir组低于高糖诱导的Bax[(50.31±2.18) vs (61.96±4.08)]、IL-6[(7.67±1.53) vs (25.33±4.16)]、MCP-1[(26.67±6.11) vs (43.33±3.06)]、TNF-α[(35.33±3.06) vs (44.67±4.16)]、NF-kB[(2.19±0.52) vs (3.58±0.53)]及caspase-3[(2.28±0.10) vs (2.86±0.12)]表达及细胞凋亡[(10.73±1.78) vs (16.46±2.24)],差异均有统计学意义(P<0.05);上调高糖抑制的Bcl-2[(0.62±0.04) vs (0.45±0.06)]的表达(P<0.05). 结论 厄贝沙坦通过NF-kB信号通路,可减轻高糖诱导的H9C2细胞炎症反应及凋亡.
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麦冬皂苷D′对大鼠心肌细胞H9c2的细胞毒性
目的 研究麦冬皂苷D′对大鼠心肌细胞H9c2的细胞毒性作用,初步探讨其作用机制,为寻找其临床安全使用剂量提供依据.方法 麦冬皂苷D′0.1,1,5,10,20,25和50μmol·L-1作用于H9c2细胞24 h.MTS法检测细胞存活率及其IC50;荧光显微镜观察细胞形态变化;高内涵免疫荧光筛选检测细胞核数目变化;流式细胞仪检测其活性氧生成、线粒体膜电位和细胞凋亡率.结果 麦冬皂苷D′0.1,1,5,10,20,25和50μmol·L-1作用于H9c2细胞24 h后,细胞存活率分别为108.9%,106.3%,91.9%,61.0%,24.8%,24.7%和24.2%,IC50为9.9μmol·L-1;荧光显微镜检测显示细胞皱缩;高内涵免疫荧光检测显示细胞核数目减少(P<0.05).流式细胞术检测显示,麦冬皂苷D′0.1,1,5和10μmol·L-1显著升高活性氧生成量(P<0.05),降低线粒体膜电位(P<0.05),升高细胞凋亡率(P<0.05).结论 麦冬皂苷D′对H9c2心肌细胞有明显的细胞毒性作用,该作用可能与其激活细胞凋亡通路有关.
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藤黄酸的心脏毒性及其基于细胞表型的多指标量化表征
目的：建立基于细胞表型心脏毒性多指标同步量化表征方法，评价广谱抗癌药藤黄酸的心脏毒性。方法采用H9c2心肌细胞系，以多柔比星（Dox）和胺碘酮（Ami）为阳性药对照，1‰DMSO为溶剂对照组，次乌头碱为阴性对照组，应用高内涵分析多通道活细胞成像，收集细胞形态变化以及各指标探针的荧光强度，考察1×10-14～1×10-8mol·L-1浓度范围药物对心肌细胞存活率、细胞核、线粒体形态和功能及胞内钙离子含量的影响，以药物半数有效量（EC50）判断药物对心肌细胞影响程度，以Z′值判断所建方法的精密度和假阳性率。结果 Dox降低细胞数，导致细胞核胀大，线粒体质量增加，EC50分别为0.72，0.014和1.21μmol·L-1，且在浓度为10μmol·L-1时导致胞内钙稳态失衡。Ami导致心肌细胞数下降，细胞核缩小及线粒体质量减少，EC50值分别为14.83，6.72和4.54μmol·L-1，高通量筛选Z′值平均为0.5。次乌头碱对心肌细胞的细胞核和胞内钙离子含量无影响，但改变了线粒体的纹理，纹理分析值降低。藤黄酸对心肌细胞有严重的杀伤作用，使细胞存活率下降，细胞核减小以及胞内钙离子浓度降低，EC50分别为0.24，1.16和0.41μmol·L-1。藤黄酸使线粒体质量降低，线粒体纹理数值降低以及线粒体面积增加，EC50分别为1.21，0.99和0.44μmol·L-1。结论使用高内涵分析多通道活细胞成像技术所评价的阳性药EC50效量和现有报道接近；多指标同步量化对藤黄酸的心脏毒性进行了较为全面的分析，并对其毒性作用机制做出初步的判断。
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载田蓟苷纳米胶束的制备及其对H9c2细胞凋亡的评价
目的 制备两亲性的载田蓟苷纳米胶束,研究其体外释药特性及协同提高其体外抗H9c2细胞凋亡的活性.方法 以两亲性二嵌段PEG-PPS聚合物为载体材料,通过溶剂挥发法制备载田蓟苷的氧化响应型纳米胶束,并对其形态、粒径分布及体外释放进行表征.采用缺氧/复氧制备H9c2大鼠心肌细胞的损伤模型,以普萘洛尔(Pro)为阳性对照,通过对受损心肌细胞形态学观测、细胞增殖及细胞相对凋亡情况的检测,评价空白胶束,田蓟苷及载田蓟苷纳米胶束对缺氧/复氧诱导H9c2细胞损伤的保护作用.结果 载田蓟苷的纳米胶束外观为球形,粒径分布均匀.载药为3.82％田蓟苷纳米胶束的平均粒径为137 nm,多分散系数为0.162,包封率为91.45％.体外释药研究表明,载田蓟苷纳米胶束无药物突释现象,具有缓释特性,且过氧化氢的存在显著地促进了田蓟苷从纳米胶束中的释放.体外细胞毒性实验表明,当田蓟苷浓度为5 μg·mL-时,载田蓟苷纳米胶束的细胞存活率显著高于相应浓度的田蓟苷和PEG-PPS聚合物纳米胶束.体外抗凋亡活性实验研究表明,载田蓟苷纳米胶束对缺氧/复氧诱导H9c2细胞的凋亡具有明显的抑制作用,具有与普萘洛尔相似的抑制凋亡作用.结论 载田蓟苷纳米胶束具有均匀的粒径及分布,缓释和氧化特性,对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤具有显著的保护和抑制凋亡作用,可作为一种有前景的纳米药物输送系统应用于心肌缺血再灌注损伤的治疗.
关键词： PEG-PPS聚合物胶束 田蓟苷 缺氧/复氧 H9c2细胞 细胞凋亡 -
南葶苈子水提物对多柔比星诱导H9c2细胞凋亡和氧化应激的抑制作用
目的 探明南葶苈子水提物对多柔比星(doxorubicine,Dox)引起的H9c2心肌细胞损伤的保护作用及潜在机制.方法 应用5 μg·mL-1 Dox处理H9c2细胞诱导建立心肌细胞损伤模型,分为对照组、模型组、阳性组、南葶苈子水提物不同剂量给药组,检测细胞活力,凋亡率,线粒体膜电位,细胞活性氧(ROS)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平,凋亡通路关键蛋白p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平,使用UPLC-MS联用的方法分析鉴定南葶苈子水提物中主要成分峰.结果 南葶苈子水提物能提高H9c2细胞活力(P＜0.01),降低凋亡水平(P＜0.01),改善线粒体膜电位水平与ROS水平(P＜0.05),改善细胞内SOD及GSH-PX酶活力、LDH、MDA水平(P＜0.01或P＜0.05),调节凋亡通路关键蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2、p53蛋白表达水平(P＜0.01或P＜0.05),同时,共分析鉴定了南葶苈子水提物中7种含量高的成分.结论 南葶苈子水提物可以有效保护由Dox引起的H9c2细胞损伤,其机制可能与改善细胞的氧化应激,抑制内源性凋亡通路,而抑制细胞凋亡的发生有关.
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紫草酸通过抑制凋亡及磷酸化P65改善脂多糖对H9c2细胞的损伤
目的 探讨紫草酸对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的H9C2细胞损伤的保护作用.方法 本实验分组为5组:对照组、LPS组、LPS加紫草酸组(低、中、高剂量).LPS浓度为2mg/ml,紫草酸浓度分别为5、10、201μmol/L.药物干预时间为12h.用CCK8检测药物对细胞存活率影响,用TUNEL、RT-PCR及Western blot法检测凋亡蛋白及信号通路蛋白的变化.结果 紫草酸对H9C2细胞具有低毒性,它可以降低胞内凋亡的水平,降低炎性反应,且具有浓度依赖性以及时间依赖性.结论 紫草酸可以改善LPS诱导H9C2细胞损伤.
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FGF21对H9C2心肌细胞H/R损伤及Angpt2、GLUT1表达的影响
目的 探讨FGF21对H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤及Angpt2、GLUT1表达的影响.方法 体外培养H9C2心肌细胞并分为H9C2组、H/R组、H/R+FGF21组,H9C2组即H9C2细胞阴性对照组,H/R组给予缺氧6 h/复氧24 h处理,H/R+FGF21组则在细胞复氧时给予FGF21(1μg/mL)处理.利用FCM检测各组细胞凋亡率,QPCR及Western blot检测各组Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表达水平.结果 H/R组细胞凋亡率显著高于H9C2组(P＜0.01).与H/R组比较,H/R+FGF21组细胞凋亡率显著降低(P＜0.01).QPCR及Western blot检测发现,与H9C2组比较,H/R组Angpt2、Caspase-3表达显著增加,GLUT1表达显著降低(P＜0.01);与H/R组比较,H/R+FGF21组Angpt2、Caspase-3表达显著降低(P＜ 0.05或P＜ 0.01),GLUT1表达显著增加(P＜0.05).结论 外源性FGF21可显著减轻H/R损伤所致H9C2细胞凋亡,抑制炎症因子Angpt2表达和增加GLUT1表达可能是其内在机制.
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EGCG对氧化诱导的心肌细胞凋亡的保护作用研究
目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对氧化应激诱导的大鼠H9C2凋亡的细胞保护作用及机制.方法 H9C2细胞传代培养后进行随机分组.阴性对照组(正常培养液培养),H2O2损伤组(100 μmol/LH2O2作用12h),EGCG低浓度组(10 μmol/LEGCG孵育24 h 后,加入H2O2作用12 h),EGCG高浓度组(100 μmol/LEGCG孵育24 h后,加入H2O2作用12h).MTT比色法检测细胞活力,Hochest33258染色观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比色法检测凋亡相关因子Caspses-3及Caspase-9的表达.结果 10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用于H9C2细胞后,细胞存活率分别提高到66.68％和78.63％,与H2O2损伤组(57.33％)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33258染色及流式细胞技术结果显示,不同浓度的EGCG作用于H9C2细胞后,细胞凋亡率逐渐下降,与氧化损伤组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);此外,EGCG能够有效抑制H9C2细胞内Caspase-3、Caspase-9的表达.结论 EGCG通过抑制Caspses-3及Caspase-9的表达有效抑制了H9C2细胞的氧化损伤,从而为其用于治疗心肌细胞损伤提供可靠的实验依据.
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H9c2细胞株在心肌缺氧/复氧实验中的应用
目的 本实验对H9c2细胞株进行缺氧/复氧,旨在引进一种操作、培养简便,可传代且功能与分离培养的原代细胞相似的大鼠心肌细胞株.方法 培养的H9c2细胞随机均匀分为常氧对照组(NC组,6只)和缺氧/复氧组(H/R组,6只).细胞置于含95%N2,5%CO2的三气培养箱内缺氧3 h,置于含95%空气、5%CO2的CO2培养箱中进行复氧培养.台盼蓝染色记数细胞,MTT法检测细胞存活率,检测培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量反映细胞损伤程度,并与在分离培养的乳鼠原代心肌细胞上进行的研究做对比.结果 与常氧组相比,H9c2细胞缺氧/复氧处理后,存活率明显降低[(68.65±7.55)%比(91.95±9.13)%,P<0.01],LDH漏出量增加[(132.38±24.07)U/L比(34.69±9.86)U/L,P<0.01].原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧处理后,LDH漏出量增加[(428.62±56.65)U/L比(116.02±23.01)U/L,P<0.01].结论 H9c2细胞株具有与原代培养乳鼠心肌细胞相似的功能特性,易于分离培养,并可传代,在缺氧/复氧等实验中具有广阔的应用前景.
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钙敏感受体(CaSR)在高糖诱导H9C2细胞氧化应激中的作用
目的 本研究旨在观察钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)在高糖诱导H9C2心肌细胞中的表达以及其对氧化应激的作用.方法 将H9C2细胞在不同条件下干预24 h,包括正常糖浓度组(NG组)、高糖组(HG组)、高糖+CaSR激动剂组(HG+GdCl3组)、高糖+CaSR抑制剂组(HG+NPS2390组).用CCK8试剂盒检测细胞存活率;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧簇(ROS)含量;用比色法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量.用Western blot检测细胞CaSR蛋白表达水平.结果 细胞存活率呈糖浓度依赖性降低[(89.00±1.54)％比(98.83±0.47)％,P＜0.01],CaSR蛋白表达量呈糖浓度依赖性增加2.14±0.09比1.06±0.05,P＜0.01).高糖诱导可使细胞发生氧化应激,SOD(14.14±0.57比22.86±0.58,P＜0.01)与GSH-Px(2.62±0.59比3.04±0.89,P＜0.01)活性降低,ROS(0.040±0.002比0.020±0.001,P＜0.01)与MDA(0.83±0.05比0.54±0.02,P＜0.01)生成增多.与HG组相比,HG+GdCl3组细胞氧化损伤加重(P＜0.05).而HG+NPS2390组细胞氧化损伤减轻(P＜0.05).结论 高糖能上调CaSR蛋白表达进而促进氧化应激的发生.
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外源性硫氧还蛋白对高糖、高脂刺激引起的H9c2细胞损伤和凋亡的影响
目的 观察给予外源性硫氧还蛋白(Trx)后对高糖、高脂刺激引起的心肌细胞损伤和凋亡的影响,并分析其可能机制.方法 将处于对数生长期的H9c2心肌细胞随机分为三组:正常对照组(普通DMEM培养基葡萄糖5 mmol/L加入20 mmol/L甘露醇)、高糖高脂组(DMEM高糖25 mmol/L培养基加入高脂600 μmol/L软脂酸)和Trx干预组(在高糖高脂组的培养基中加入3 *9滋mol/L Trx).培养48 h后,分别收集培养基上清与细胞,进行指标检测.结果 与正常对照组比较,高糖高脂组乳酸脱氢酶及caspase-3活性均显著升高(P＜0.01).给予Trx干预后,与高糖高脂组比较,Trx干预组乳酸脱氢酶及caspase-3活性均显著下降(P＜0.01).与正常组比较,高糖高脂组Trx的表达量未见明显改变(P＞0.05),但是Trx活性显著下降(P＜0.01).结论 高糖、高脂刺激可以引起H9c2心肌细胞损伤和凋亡,其机制与内源性Trx活性的降低有关.外源性补充Trx可明显提高Trx的活性,减轻心肌细胞的损伤和凋亡.
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siRNA表达载体对大鼠心肌H9c2细胞牛磺酸合成限速酶—CSD基因表达的抑制作用
目的 研究siRNA对大鼠心肌半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)的抑制作用.方法 根据已克隆的大鼠心肌CSD基因序列(EU786150)设计并构建了4个siRNAs及1个阴性对照siRNA表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒siRNA1#、siRNA2#、siRNA3#、siRNA4#及阴性对照质粒分别转染H9c2细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、四唑盐(MTT)法检测H9c2细胞增殖情况、实时荧光定量PCR和Western-blot检测CSD mRNA和蛋白表达.结果 荧光显微镜观察细胞转染效率达70％左右；与阴性对照组、未转染组比较,siRNA1#重组质粒显著抑制了H9c2细胞中CSD mRNA和蛋白的表达(P＜ 0.05),而siRNA4#质粒对CSD表达无明显抑制效应(P＞0.05)；MTT检测结果表明转染重组质粒siRNA1#、siRNA2#进入H9c2细胞48 h、72 h后细胞增殖明显受抑制,与阴性对照组、未转染组相比差异均达到显著水平(P＜0.05). 结论 siRNA1#重组质粒能有效抑制CSD基因的表达,且显著抑制H9c2细胞增殖,为研究CSD基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础.
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辽东楤木单体化合物的结构修饰及生物活性研究
目的 基于药用植物辽东楤木Aralia elata中的单体五环三萜皂苷类天然产物齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸进行结构修饰,并对其结构修饰物进行体外心肌保护活性研究.方法 分别以苷元齐墩果酸和熊果酸为起始原料,通过苄基保护、糖苷化、苄基脱保护、酰胺化、苯甲酰基脱保护共5步反应制得目标化合物,利用H9c2细胞评价该类衍生物的心肌保护活性.结果 设计并合成10个辽东楤木单体化合物的结构衍生物F1～F10,均经波谱技术确证结构.药理结果表明,10个化合物对H9c2细胞呈现不同程度的心肌保护活性,其中化合物F3的心肌保护活性与先导物活性相当.结论 化合物F1～F10均为未见文献报道的新化合物,具有潜在的心肌保护活性,值得深入研究.
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木豆叶提取物对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用及机制研究
目的 研究木豆叶提取物(ECCL)对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制.方法 建立H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型,于H2O2刺激前加入PI3K信号通路阻断剂LY294002 (LY)预处理10 min,加入20、50 μg/mLECCL预处理24 h.MTT法检测细胞存活率,比色法测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,Western blotting检测细胞内p-Akt、p-eNOS蛋白表达.结果 与模型组比较,ECCL可明显增加H9c2细胞H2O2损伤后细胞存活率(P＜0.01),增加SOD活力,降低MDA、LDH水平,增加p-Akt和p-eNOS蛋白表达(P＜0.05、0.01),LY可阻断ECCL对H9c2的上述作用.结论 ECCL能够减轻H2O2所致的H9c2细胞损伤,可能是通过激活PI3K通路促进其下游因子Akt和eNOS磷酸化发挥作用.
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外源性H2S恢复缺氧后适应对衰老H9C2细胞的保护作用及机制
目的:探讨外源性硫化氢(H2S)恢复缺氧后适应对衰老H9C2细胞的保护作用及相关机制.方法:H9C2细胞(心肌细胞系)用30μmol/L过氧化氢(H2O2)处理2h后再培养3d,诱导生成衰老细胞.衰老H9C2细胞被随机分5组(n=8):正常组(Control)、缺氧/复氧组(H/R)、H/R+NaHS组、缺氧后适应(PC)组、PC+NaHS组.缺氧/复氧(H/R)模型:衰老H9C2细胞用缺氧液(无血清、无糖培养基,pH=6.8)培养3h,然后正常培养6h;缺氧后适应(PC)模型:方法同H/R模型,缺氧结束复氧前连续进行3次5 min间隔的复氧/再缺氧处理,随后复氧6h.ELISA试剂盒分别检测大鼠晚期糖基化终末产物(AGEs)含量和caspase-3活性;CCK-8试剂盒检测细胞活力;DCFH-DA染色检测活性氧(ROS)水平;Hoechst 33342染色检测细胞凋亡率;Real-time PCR检测相关基因mRNA水平.结果:30 μmol/L H2O2可诱导H9C2细胞衰老但不会导致其凋亡;与Control组比较,H/R和PC均降低细胞活力,增加细胞凋亡率、ROS水平及caspase-3、caspase-9和Bcl-2 mRNA水平(P＜0.01);且PC组与H/R组比较,上述指标变化无明显差异;在H/R和PC组加入NaHS,可显著提高细胞活力,降低细胞凋亡率和氧化应激;PC+NaHS对上述指标的作用明显强于H/R+NaHS.结论:外源性H2S能够恢复PC对衰老H9C2细胞的保护作用,其机制与抑制氧化应激和细胞凋亡有关.
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缺氧预适应诱导人脐静脉内皮细胞释放的微囊泡对正常H9c2细胞的作用
目的:分离提取缺氧预适应(HPC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌的微囊泡(MVs),探讨HPC-EMVs对正常H9c2心肌细胞的作用和其Caspase 3、Bcl-2和Bax表达的影响.方法:采用HPC方法诱导HUVECs释放MVs,将其和正常培养的大鼠H9c2心肌细胞孵育,通过MTT法检测细胞存活率和比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;通过Hoechst 33258染色观察细胞核的形态变化;比色法测定培养液中Caspase 3活性以及Western blot法检测H9c2细胞中Bcl-2和Bax的表达.结果:HPC模型构建过程中,与缺氧/复氧(H/R)组相比,HPC组细胞存活率显著升高(P＜0.01),即成功构建HUVECs的HPC模型;HPC-EMVs处理H9c2细胞结果发现,与对照组H9c2细胞相比,HPC-EMVs 30、60μg/mL组细胞存活率显著降低(P＜0.001),且LDH活性和Caspase 3活性显著升高(P＜0.01或P＜0.001),凋亡细胞量增加,Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.001).结论:成功采用HPC的方法诱导HUVECs释放MVs,HPC-EMVs通过影响正常H9c2细胞Caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白的表达发挥促凋亡作用.
