肠道病毒EV71及CA16在不同细胞系中细胞病变作用的研究

目的研究CA16和EV71在4种细胞系中细胞病变作用的差异.方法随机选择滴度相似的EV71轻症、EV71重症和CA16轻症毒株各1株,分别感染RD、Vero、U251和SY5Y细胞,比较3株病毒在细胞病变的形态及程度、感染后的细胞存活率、病毒在细胞中的复制水平和病毒所致凋亡蛋白相关mRNA的表达水平等方面的差别.结果3株病毒的感染在同一细胞系中表现相似.镜下从形态学上无法对三株病毒加以区别;感染后病毒载量均表现为从高到低依次为Vero、RD、SY5Y细胞到U251细胞的顺序;病毒感染后细胞存活率的顺序与细胞内复制水平与相反,两者之间存在类似负相关的趋势.3株病毒的感染在3种细胞系中均有凋亡蛋白caspase-8、9和3相关mRNA的表达,提示可能3种细胞系中凋亡启动的途径相同.结论细胞水平的感染,提示这两种病毒感染所致临床表现的差异性并非单独由病毒所决定.

人7型腺病毒检测细胞系的构建与鉴定

目的 构建人7型腺病毒(human adenovirus type 7,HAdV7)检测细胞系.方法 将HAdV7中的Hexon基因克隆至带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)-Puro上,获得pLV-EGFP-hexon.将其与包装质粒p-Pax、pMD用脂质体Lip2000共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素压力筛选和系列的稀释法,获得HAdV7感染的检测细胞系HEp-2/GFP. 结果 细胞系HEp-2/GFP感染HAdV7后24 h,可观察到GFP的表达绿色荧光,而作为对照组的HEp-2/GFP细胞感染双链DNA病毒(如EB病毒和乙型肝炎病毒),并未观察到绿色荧光.此检测细胞系用不同滴度的HAdV7感染,至少可以检测到10 PFU/mL滴度的HAdV7.结论 成功构建了能检测HAdV7的细胞系HEp-2/GFP,且其检测的特异性和敏感性良好,可以作为检测HAdV7感染的诊断方法之一.

戊型肝炎病毒细胞培养的进展与应用

戊型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病,因其致病因子戊型肝炎病毒(HEV)的细胞培养一直不很成功,影响了戊肝研究的深入.学者们在这方面进行了大量研究,尝试了各种不同来源的细胞和不同的培养条件,积累了很多经验,其中一些细胞系已试试用于HEV的检测和疫苗的筛选.本文就HEV细胞培养方面的进展与应用作一介绍.

微量高通量细胞培养法在脑炎病毒分离中的应用

目的 建立用微量高通量、多细胞谱培养法分离未明原因脑炎患儿中病毒的方法,探讨脑炎患儿中肠道病毒的感染情况.为大量、及时分离病毒、病毒鉴定和分子流行病学研究奠定基础.方法 将8株不同的细胞接种于96孔细胞培养板中,每种细胞接种一行,细胞长成单层后孔内接种脑脊液标本,每孔5-10μl,每份标本纵向接种8孔(8种细胞系),35℃、5%CO2培养.出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)者传代培养两次.两次均出现CPE者视为细胞培养阳性,-70℃保存用于病毒鉴定.将培养物首先用肠道病毒通用引物做逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)并测序,进行初步筛查.结果 93份标本中有56份出现明显的CPE,病毒分离率为60.22%(56/93),其中在MA104细胞出现病变者40份,阳性率为43.01%.其中6份培养物的RNA用肠道病毒通用引物得到了扩增,序列测定确定为肠道病毒.结论 微量多细胞培养法具有简便、快速等特点,适合用于病毒的初步筛查.

戊型肝炎病毒细胞培养的进展与应用

戊型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病,因其致病因子-戊型肝炎病毒(HEV)的细胞培养一直不很成功,影响了戊肝研究的深入.学者们在这方面进行了大量研究,尝试了各种不同来源的细胞和不同的培养条件,积累了很多经验,其中一些细胞系已试用于HEV的检测和疫苗的筛选.本文就HEV细胞培养方面的进展与应用作一介绍.

05 乙脑病毒的减毒变异株CH2195LA的全核酸序列和细胞系增殖模型

用囊胚内细胞团建立小鼠胚胎干细胞系的尝试

目的 建立小鼠129品系胚胎干细胞(ES)系.方法 分离囊胚内细胞团接种至小鼠胚胎成纤维细胞,培养、传代以获得细胞系,通过形态观察、碱性磷酸酶检查、体内外分化实验予以鉴定.结果 共获取12个囊胚,培养后有9个内细胞团增殖,消化传代,分离出2株克隆;形态观察具有明显的ES细胞形态,染色体核型检查为XY,碱性磷酸酶检查细胞呈阳性,体外分化实验表明可自发分化为外、中和内胚层细胞,体内分化实验获得典型的畸胎瘤,并具备小鼠特异性表面标志物Oct-4、SSEA-1.结论 应用本方法建立了两株129品系胚胎干细胞系,并证实其符合小鼠胚胎干细胞的特征.

1-01 c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型

目的建立促癌剂检测模型.方法采用电穿孔的方法,将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38及人支气管上皮细胞BEAS-2B中,将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后,进一步用促癌剂佛波醇酯(PMA)处理,并选用克隆形成率(CFE)、锚着独立性生长(AIG)、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测.结果 c-Ha-rasV12G基因使细胞对促癌剂的促癌敏感性增强,其中,对于WI-38G418r细胞,当PMA剂量分别为0、3.125×10-5、6.25×10-5、1.25 × 10-4、2.5×10-4及0.5×10-3mol/L时,其在含体积分数为1%FBS的1640培养基中的克隆形成率分别为7、8、11、12、15及14/200 cells,在含体积分数为10%FBS的培养基中分别为76、92、106、109、127及173/200 cells,在质量浓度为0.33%的琼脂中为47、61、70、69、80及97/1 000 cells.选取0.5×10-3 mol/L剂量组处理的G418r细胞进行裸鼠成瘤性实验,结果阳性.对照非基因转染细胞,用0.5×10-3 mol/LPMA处理后,在3种培养基中相应的克隆形成情况为3、33/200 cells,0/1 000 cells,裸鼠皮下注射部位无肿瘤生长.PMA以0、2.0×10-5、1.0×10-4、5.0×10-4、1.0×10-3及1.6×10-3 mol/L分别作用24 h,结果1.0×10-4 mol/L剂量作用使BEAS-2B G418r细胞获得了高的血清抗性及CEF,表现为在含体积分数为0.8%、0%FBS的LHC-8培养基及软琼脂中的CEF分别为190%、150%及75%(对照非基因转染细胞在不含PMA及FBS的LHC-8中CEF计为100%),对照细胞在含体积分数为0.8%FBS的培养基及软琼脂中不能生长,随着PMA处理剂量的增加,其CFE逐渐降低.结论 c-Ha-rasV12G基因可使上皮细胞BEAS-2B获得对PMA的促癌作用敏感性,其中当PMA剂量≤1.0×10-4mol/L时,可发挥促癌作用,大于该剂量则有促分化作用;上皮细胞发生恶性转化的标志之一是细胞对FBS、PMA等促分化剂的促细胞分化抗性增强.

佛波酯诱导THP-1细胞分化条件的优化及自噬模型的建立

目的 探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞(人类单核/巨噬细胞)分化的优条件,建立相关自噬模型,为基于细胞自噬模型的研究奠定实验基础.方法 采用PMA诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞;用表达融合蛋白pcDNA3.1-YFP-LC3质粒转染THP-1细胞,YFP为黄绿色荧光蛋白,以示踪自噬体的形成.采用倒置显微镜观察不同浓度(0、10、20、50、100、200 ng/ml)、不同时间(0、24、48、60 h)PMA分化细胞形态学变化;采用荧光显微镜示踪不同条件下LC3点聚集的增强;实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测自噬相关基因mRNA的表达.采用SPSS17.0软件进行统计分析.mRNA相对含量2-△△Ct用“(x)±s”表示.经比较Ct值法分析基因表达差异.Earle's balanced salts solution(EBSS,又称饥饿培养基),诱导细胞自噬相关基因mRNA表达量变化的比较采用t检验分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 PMA浓度为100 ng/ml、诱导时间为24～48 h时,THP-1细胞分化成巨噬细胞的形态学状态较理想.饥饿培养基EBSS处理分化的THP-1细胞,能增加自噬体YFP LC3点聚集,其自噬相关基因LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表达水平显著增加(2-△△Ct均值分别为1.35±0.16、1.18±0.39、1.44±0.12、1.08±0.09,t值分别为4.00、2.90、5.16、3.57,P值均＜0.05).结论 PMA在浓度为100 ng/ml、24～48 h时诱导THP-1分化为巨噬细胞状态较理想;成功构建了THP-1源性细胞自噬模型.

γ干扰素活化的THP-1源巨噬细胞杀伤荧光BCG的实验研究

目的 研究γ干扰素(IFN-γ)活化的THP-1源巨噬细胞对BCG的杀伤作用,并探讨其杀伤机制是否与自噬有关.方法 Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,也称佛波酯)诱导THP 1分化成巨噬细胞.牛分枝杆菌减毒株荧光BCG以感染复数MOI(multiplicity of infection,细菌数与细胞数的比例)10∶1感染未活化(Control组)、IFN-γ活化(IFN γ组)、Rapamycin诱导自噬(Rapa组)、3甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬(IFN-γ+3-MA组)4组不同预处理的巨噬细胞.感染48 h后,超纯水裂解细胞,收集裂解液和培养上清混合,相同比例取各组混合液10μl,连续10倍稀释3次涂7H10平板培养基,置37℃生化培养箱培养,第3至4周观察记录菌落数,计算生存率[control组的菌落数为分母,其他组(包括control组)的菌落数为分子相除得到的数值为生存率].同时在感染过程的不同时间点裂解细胞提取总蛋白,以Western blot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达,监测细胞自噬水平的变化.实验结果数据以3次重复实验数据的“(-x)±s”形式展示(Western blot结果除外,只采用其中一个结果数据为代表).用SPSS 17.0软件进行统计分析:巨噬细胞贴壁率比较和凋亡率比较用两独立样本t检验;巨噬细胞活化后不同时间点分泌的TNF-α浓度比较和BCG感染各组巨噬细胞后的生存率比较用One-Way ANOVA检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 BCG感染各组巨噬细胞48 h后的生存率:Control组为(100％±0％),IFN-γ组(45％±3％),Rapa组(48％±3％),IFN-γ+ 3-MA组(91％±2％).BCG生存率经One-Way ANOVA检验,与Control组(未活化组)比较:IFN-γ组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;Rapa组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;IFN-γ+ 3-MA组BCG生存率无下降(P=0.13),细胞自噬水平无增高.结论 BCG感染巨噬细胞,或者说巨噬细胞吞噬BCG,两者的相互作用微妙而复杂.巨噬细胞在IFN-γ活化期间遭遇BCG,可以明显杀伤BCG,杀伤机制与自噬有关.

昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究

目的:探讨昆明鼠胚胎内细胞团分离方法、原代干细胞克隆分离时机及干细胞传代方法对干细胞建系效率的影响.方法:取昆明鼠3.5d囊胚建胚胎干细胞系,比较全胚培养法与免疫外科法两种内细胞团分离方法对胚胎干细胞建系效率的影响,观察原代克隆的分离时机,机械法传代和酶消化传代对胚胎干细胞建系效率的影响.结果:全胚培养法30个囊胚建系3个,免疫外科法32个囊胚建系4个,两组均可以有效地形成胚胎干细胞系；昆明鼠原代干细胞克隆分离佳时机是增殖4～6 d;5代以前的干细胞以机械传代方法较好,5代后用酶消化法传代效果较好.结论:全胚培养法和免疫外科法均能有效建立昆明鼠胚胎干细胞系,采用机械化与酶消化法相结合传代更适合昆明鼠干细胞建系.

抗玉米赤霉烯酮单克隆杂交瘤细胞系的建立及单抗生产

为快速检测食品中的玉米赤霉烯酮(Zearalenone以下简称ZEN),建立了抗ZEN的单克隆杂交瘤细胞株.用ZEN-BSA偶联物免疫8～10周龄雌性BalB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过4～5次亚克隆建立了稳定分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Z2A4、Z8D6.将上述2种杂交瘤细胞分别注入BalB/c小鼠腹腔,获得含抗ZEN单克隆抗体的腹水.将腹水用饱和硫酸铵盐析法纯化,得到Z2A4、Z8D6单克隆抗体.经鉴定,其亚类为IgG,抗体腹水效价Z2A4和Z8D6分别为1:1.6×106和1:3.2×106;分子量均为150000(150kD);参考工作浓度分别为1:40000和1:100000;纯化后抗体IgG含量分别为34和39 mg/ml;抗体与其它霉菌毒素无交叉反应(交叉反应率＜1%),具有较高特异性;抗体亲和力常数Z2A4和Z8D6分别为5.52×108和4.68×109 mol/L.

FADD基因的研究进展

1995年,Chinnaiyan等利用酵母双杂交系统成功地克隆出一种能与 Fas相互作用而诱导细胞凋亡的蛋白,由于其包含一个与 Fas的死亡结构域 ( death domain)同源的结构域,故命名为 Fas相关死亡结构域蛋白 ( Fas- associated death domain protein,FADD),由于观察到该蛋白在多种细胞系中均能诱导凋亡的发生,因而认为其是一个凋亡分子.其后对FADD进行了深入的研究,发现 FADD不仅在凋亡信号传导通路中起重要作用,而且在 T细胞的增殖、胚胎的发育等方面也有一定的作用.FADD基因的突变及异常表达亦可能参与多种肿瘤的发生发展.目前对 FADD的研究日益受到重视并不断深入.

2,3,7,8-四氯二苯并二噁英对人芳香烃受体和转化生长因子α mRNA表达的影响

目的 研究2,3,7,8-四氯二苯并二嗯英(TCDD)染毒对表皮细胞芳香烃受体(AhR)和转化生长因子(TGF-α)表达的影响.方法 利用半定量逆转录PCR技术(RT-PCR)对24 h TCDD染毒组进行AhR和TGF-α基因表达的测定,并分析两者之间的相互关系.结果 以β-actin为内参照,测定细胞中AhR和TGF-α mRNA表达的相对含量.结果 显示随着TCDD浓度的增高,细胞中AhR mRNA的相对表达量呈现下降的趋势,r=-0.548,各染毒组与对照组相比差异有统计学意义(F=4.124,P=0.021),两两比较7×10-10 mol/L组(0.0620±0.0085)和7×10-9 mol/L组(0.0518±0.0194)与对照组(0.1138±0.9227)之间的差别有统计学意义(t=-3.48,P＜0.05;t=-4.17,P＜0.01),且其相对表达量分别为对照组的55%和45%.TGF-α mRNA的相对表达量随浓度的增加则呈现上升的趋势,相关系数r=0.695(P＜0.01),各组之间差异有统计学意义(F=15.789,P=0.000),在7×10-10 mol/L组(0.1474±0.0390)和7×10-9 mol/L组(0.2133±0.0364)相对表达量与对照组(0.0561±0.0100)的差别具有统计学意义(t=4.49,P＜0.01;t=7.74,P＜0.01),且其相对表达量是对照组的2.6倍和3.8倍.同时对AhR与TGF-α mRNA相对表达水平进行相关分析,两者呈负相关,r=-0.561(P＜0.05).结论 TCDD对细胞增殖过程中可影响基因表达,AhR表现为下调,TGF-α表现为上调,且两基因表达量之间存在负相关关系.

佛波酯对BALB/c 3T3细胞转化早期基因表达的影响

目的探讨佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)促进细胞转化早期基因表达谱的变化.方法以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)为启动剂,TPA为促癌剂,建立BALB/c 3T3细胞转化模型.采用锥虫蓝染色法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.采用cDNA微阵列检测TPA处理早期的基因表达谱变化.结果 TPA处理早期可抑制细胞增殖,阻滞细胞于G1期与S期.TPA处理4 h和24 h后,在检测的1 152个基因中筛选出19个差异表达基因,其中9个基因表达上调,10个基因表达下调.许多差异表达基因的功能与细胞增殖、凋亡和周期调控相关,主要涉及ras和p53基因信号传导通路.结论 TPA在促进BALB/c 3T3细胞转化的早期阶段,可影响某些调节细胞周期进展基因的转录表达,从而导致细胞生长阻滞.

柠檬酸镱诱导肝癌细胞HepG2凋亡作用及蛋白质表达变化研究

目的 研究稀土配合物柠檬酸镱([YbCit2]3-)诱导人肝癌HepG2细胞株凋亡的作用及其机制.方法 用DMEM培养基培养人肝癌细胞株HepG2细胞,以DMEM无血清培养细胞为对照组,以0.01～5.00 mmol/L[YbCit2]3-无血清培养基培养组为处理组,应用四噻唑蓝(MTT)法检测[YbCit2]3-对HepG2细胞生长的影响;以2.00 mmoL/L[YbCit2]3-无血清培养基培养组为处理组,Hoechst 33258染色法考察[YbCit2]3-对细胞的作用,采用差异蛋白质组学及H2O2、线粒体膜电位检测的方法研究[YbCit2]3-对HepG2细胞作用的可能机制.结果 2.00～5.00 mmol/L浓度范围内处理72 h,[YbCit2]3-能抑制HepG2细胞的生长,半数抑制浓度(IC50)值为(2.46 ±0.23)mmol/L.2.00 mmol/L[YbCit2]3-处理HepG2细胞48、72 h,Hoechst 33258染色检测表明其作用是诱导HepG2细胞凋亡.HepG2细胞经2.00 mmol/L[YbCit2]3-处理72 h后,通过双向电泳分离和质谱鉴定,鉴定出14个差异表达蛋白质点,包括丝切蛋白1、过氧化物氧化还原酶6、S100钙结合蛋白A6、蛋白酶26s非ATP酶亚基13亚型3等在细胞中分别参与抗凋亡、氧化还原、细胞增殖、蛋白降解等过程的蛋白质.2.00 mmol/L[YbCit2]3-分别作用HepG2细胞24、48 h后,细胞线粒体膜电位检测红绿荧光比值对照组为2.45 ±0.28,24 h组为1.56 ±0.23,48 h组为1.16 ±0.18,与对照组比,差异具有统计学意义(F=23.97,P=0.001);胞内H2O2检测荧光强度对照组为20.00 ±2.08,24 h组为40.00 ±5.50,48 h组为48.00±2.03,与对照组相比,差异具有统计学意义(F=48.40,P=0.000),表明[YbCit2]3-作用后线粒体膜电位下降,H2O2产生增加.结论 [YbCit2]3-可通过调节胞内氧化应激水平和线粒体凋亡途径诱导HepG2癌细胞凋亡.

NS-398对肝癌细胞系HepG2环氧合酶-2表达的影响

目的 研究环氧合酶-2(COX-2)抑制剂氮-2,环己氧-4,硝基苯-甲基磺胺(NS-398)对肝癌细胞株HepG2细胞体外抗肿瘤作用,探讨其抗癌作用的分子机理.方法 分别用100、200、300、400μmol/L NS-398处理HepG2细胞,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定肿瘤细胞增殖抑制率,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期的改变及凋亡百分比的变化,用Westen blotting检测COX-2蛋白的表达,用放射免疫测定法检测NS-398对HepG2细胞前列腺素E2(PGE2)释放水平.结果 NS-398呈剂量依赖性的方式抑制HepG2细胞增殖,并诱导其凋亡,细胞周期分析表明,随着浓度增大,S期细胞明显减少,有G1期细胞累积现象,24 h时半数有效剂量(IC50)为300μmo/L.NS-398明显抑制COX-2的活性和表达.随着浓度的增加,其COX-2蛋白表达逐渐降低,100、200、300、400μmol/L NS-398组灰度值分别为1515.1±127.2、1023.5±108.4、691±94.3和493.6±86.6,与对照组1822±157.4相比差异有统计学意义(t值分别为3.736、1.623、1.810、2.587,P<0.01).NS-398可明显抑制HepG细胞PGE2释放水平,其吸光度值(A值)分别为0.70±0.02、0.48±0.02、0.29±0.01和0.18±0.01,与对照组比较0.03±0.01差异有统计学意义.结论 NS-398对肝癌细胞增殖有抑制作用并诱导其凋亡,可能与细胞G1期阻滞以及通过抑制COX-2活性,抑制COX-2下游产物PGE2表达有关.

人胚胎干细胞研究的现状与前景

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCS)分离出来的多潜能细胞系.它具有与早期囊胚ICM或PGCs相似的生物学特性,在体外能够保持正常二倍体核型和未分化状态,并且有多方向分化潜能.在适当条件下,ES细胞可被诱导分化为多种细胞、组织,也可以与受体胚胎嵌合,形成嵌合体.1998年,美国威斯康星大学Thomson等[1]率先成功分离、克隆了人胚胎干细胞,并建立了细胞系,这一研究成果立刻在国际上引起轰动,成为世界关注的焦点.由于人ES细胞具有其它哺乳动物ES细胞的一般特性,能够在适宜条件下分化成构成人体的任何一种组织.因此,人ES细胞能够为组织工程研究提供可靠的细胞来源,同时能够在人早期胚胎发生、细胞组织分化以及基因调控等研究领域发挥重要作用.基于此,笔者针对人胚胎干细胞的研究进展及其应用前景做一简要回顾[1-10].

新加良附药物血清体外抑制肿瘤细胞活性研究

目的 研究新加良附药物血清体外抑制肿瘤细胞生长效应.方法 采用MTT法测定新加良附药物血清对人正常肝细胞L-02、人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞BGC-823、人食管癌细胞ECA-109、人乳腺癌细胞MCF-7生长抑制率影响.结果 新加良附药物血清对正常人肝细胞无抑制生长作用;对肿瘤细胞均有不成程度抑制效应,而对BGC-823、ECA-109细胞抑制效果佳,并与用药剂量呈正相关性.结论 新加良附药物血清体外具有明显的抗消化道肿瘤活性作用,且对正常细胞无明显影响.

109 豆茶决明提取物对CHO-K1细胞系细胞周期的影响及其对丝裂霉素C诱导染色体畸变的抑制作用