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一种快速制备甲胎蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的方法
目的 建立一种快速制备甲胎蛋白单克隆抗体(AFP-McAb)杂交瘤细胞系的方法. 方法 以常规和改良两种方式同时免疫8～12周Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合并行次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养.用间接酶链免疫吸附试验法(ELISA)筛选阳性克隆株,并建立细胞系. 结果 在较短时间内,改良法能获得高效价的免疫抗体,与常规免疫法相比有极显著差异(P＜0.001),同时改良法的细胞融合率和抗体阳性率也显著高于常规免疫法(P＜0.001).筛选获得的高效分泌抗人AFP-McAb的阳性杂交瘤细胞珠进行了初步鉴定. 结论 新的改良方法优化了常规的McAb制备中动物免疫程序,并能成功筛选出AFP-McAb杂交瘤细胞系.
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对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定
重氮化法使对氧磷(E600)与牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白偶合合成人工抗原.用人工抗原E600-BSA免疫Balb/c小鼠,然后将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞和E600-BSA免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞融合,成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株.并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测.上述杂交瘤细胞连续传代或冻存10周,其分泌抗体水平稳定.
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抗玉米赤霉烯酮单克隆杂交瘤细胞系的建立及单抗生产
为快速检测食品中的玉米赤霉烯酮(Zearalenone以下简称ZEN),建立了抗ZEN的单克隆杂交瘤细胞株.用ZEN-BSA偶联物免疫8～10周龄雌性BalB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过4～5次亚克隆建立了稳定分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Z2A4、Z8D6.将上述2种杂交瘤细胞分别注入BalB/c小鼠腹腔,获得含抗ZEN单克隆抗体的腹水.将腹水用饱和硫酸铵盐析法纯化,得到Z2A4、Z8D6单克隆抗体.经鉴定,其亚类为IgG,抗体腹水效价Z2A4和Z8D6分别为1:1.6×106和1:3.2×106;分子量均为150000(150kD);参考工作浓度分别为1:40000和1:100000;纯化后抗体IgG含量分别为34和39 mg/ml;抗体与其它霉菌毒素无交叉反应(交叉反应率＜1%),具有较高特异性;抗体亲和力常数Z2A4和Z8D6分别为5.52×108和4.68×109 mol/L.
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抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备高特异性和高亲和力的抗人肝细胞肝癌(HCC)的单克隆抗体(MAb),为肝癌的靶向诊断及治疗提供依据.方法 用人肝细胞肝癌细胞株HepG-2经"尾静脉.脾脏联合方法"免疫BALB/c小鼠.取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合,经ABC免疫组化初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术(LSCM)进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型及荷人肝癌裸鼠牛物分布等进一步鉴定其生物学特性.结果 (1)获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤;该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5%(67/68);(2)注射131I-MAb后瘤部位放射性分布有逐渐增加的趋势,血液、肝脏、肾脏和肺脏放射性有逐渐减低的趋势,72 h肿瘤/血液和肿瘤,肝脏比值分别为15.76±3.28和7.23±1.70.结论 成功制备抗人肝细胞肝癌的单克隆抗体,具有较好的肝癌特异性、靶向性,对原发性肝癌有潜在的诊断及治疗作用.
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嗜人按蚊中肠单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的制备并鉴定抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体杂交瘤细胞株. 方法用嗜人按蚊中肠做抗原,用细胞融合技术制备单克隆抗体,并采用ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定.结果建立了1株持续分泌抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体的杂交瘤细胞株.BALB/c小鼠腹水单克隆抗体的高稀释度达1:12 800;单克隆抗体的重链属IgG1亚类;Western blot证实单抗能与嗜人按蚊中肠抗原特异性结合.结论成功制备了抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体.
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抗ADAMTS13单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
目的:建立分泌抗ADAMTS13单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备针对ADAMTS13不同结构域的单克隆抗体.方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截短型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠.用ELISA方法测定免疫小鼠与ADAMTS13-T7蛋白的抗血清效价.取小鼠脾脏,制成单细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞以10:1的比例混合,进行细胞的融合,并将杂交瘤细胞稀释培养.2周后选生长良好的克隆孔检测,阳性克隆孔扩大培养并再次检测.结果:获得真核表达截短型血管性血友病因子裂解蛋白酶ADAMTS13-T7蛋白纯品.利用真核表达的截短型ADAMTS13-T7蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,ELISA检测免疫后抗血清效价约为1:20 000.利用杂交瘤技术通过融合,获得多株分泌抗重组ADAMTS13抗体的杂交瘤单克隆细胞株.将其中的30株转入液氮中冻存,以备进一步分选及功能研究.结论:融合获得多株分泌抗重组ADAMTS13抗体的杂交瘤单克隆细胞株,为进一步筛选出具有一定功能活性的单克隆抗体及研究ADAMTS 13结构和功能提供更多的有力工具.
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H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究
目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.
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鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定
目的鼠抗人OX40L分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定. 方法以高表达人OX40L分子的转基因细胞L929/OX40L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以L929/OX40L为阳性抗体筛选细胞,L929/mock为阴性抗体筛选细胞,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人OX40L分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Western blot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和3H-TdR增殖试验等对单抗进行生物学特性的鉴定. 结果成功获得3株持续、稳定分泌鼠抗人OX40L单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为9H10、4C12和1G1.对单抗的生物学功能的研究结果表明,3株单抗均能识别活化B细胞和成熟DC表达的OX40L分子,且能抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用,并与阻断型抗人B7-1单抗具有协同作用. 结论获得的3株分泌鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的杂交瘤,所分泌的抗体具有特异性地识别人OX40L分子并能阻断OX40/OX40L共刺激信号及抑制DC对T细胞的激发作用.
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两株鼠抗人GL50单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步研究
目的研制鼠抗人GL50分子单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究. 方法以天然高表达人GL50分子的Daudi细胞为免疫原,人GL50-L929转基因细胞为目的单克隆抗体(McAb)的筛选细胞,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,获得分泌特异性鼠抗人GL50分子McAb的杂交瘤细胞株;免疫荧光标记和流式细胞术分析McAb识别GL50的表达;Western blot检测抗体对特异性细胞膜蛋白的识别;台盼蓝(Trypan blue)染色细胞计数法和MTT法检测McAb对Daudi 细胞体外生长的抑制作用;3H-TdR法检测抗体对GL50-L转基因细胞介导的活化T细胞体外增殖的效应. 结果成功制备2株分泌特异性抗人GL50抗体的杂交瘤细胞株12B11和11C4;两者皆为IgG2a亚型;腹水效价皆在1∶1000以上;12B11、11C4特异性地识别GL50分子.11C4 McAb可以明显抑制Daudi细胞在体外的生长,并可抑制GL50-L转基因细胞介导的活化T淋巴细胞的体外增殖效应. 结论成功获得了2株特异性鼠抗人GL50抗体,其中11C4 McAb具有诱导表达GL50分子的B淋巴瘤细胞Daudi的体外生长抑制作用;在T淋巴细胞体外增殖反应中发挥了重要的调节作用.
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单克隆抗体:从80年代的魔弹到当今临床应用的主流——第七届国际人抗体和杂交瘤会议简介
新型单克隆抗体的治疗性试验及开发的新方法构成了1999年9月8日～10日在英国爱丁堡召开的第七届国际人抗体和杂交瘤会议上讨论的核心问题.大会分新兴的抗体工程技术、分子生物学、自体免疫/变态反应性疾病、肿瘤、感染性疾病和临床应用等六个方面进行了专题报告.
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狂犬病毒核蛋白单抗和荧光抗体中和试验的建立与应用
目的建立狂犬病毒血清中和抗体效价的快速检测方法,以实现狂犬疫苗免疫效果的定量评价,指导高危人群及动物种群的免疫预防.方法采用常规方法建立杂交瘤细胞株并制备抗狂犬病毒核蛋白单抗,以亲和层析法进行纯化,异硫氰酸荧光黄标记制备荧光抗体;以BHK-21细胞系培养狂犬病毒细胞适应株CVS-11,以染毒细胞测定荧光抗体的工作浓度后,通过荧光抗体染色法测定CVS-11细胞半数感染量(TCID50);利用狂犬病毒灭活疫苗免疫犬制备抗狂犬病毒血清,并以国际兽疫局标准品进行标定;参考世界卫生组织及国际兽疫局推荐方法,确定中和试验程序,对51份样品血清进行测定,并与国际狂犬病参考实验室的检测结果进行比较,评价其精确及可靠程度.以Kaber法公式和Microsoft Excel(R)软件为基础,设计被测样品中和效价计算方法.结果制备的抗狂犬病毒核蛋白单抗的亚型为IgG2a;纯化、标记后的荧光抗体工作浓度为1:400;CVS-11株的使用量为每孔100 TCID50;本研究建立的检测程序对51份人及犬血清测得的中和效价结果与国际参考实验室的测定结果一致;自行设计的计算方法操作简便,计算快捷.结论成功建立了与国际标准相当的狂犬病毒中和抗体效价测定和计算方法.
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人Survivin基因克隆和单克隆抗体的研制及在肝癌中的表达
目的对人Survivin基因进行克隆,制备和鉴定针对人Survivin的单克隆抗体,检测Survivin在肝癌中的表达.方法利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞MCF-7扩增克隆Survivin 基因,构建可表达Survivin蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中表达MS-Survivin融合蛋白.以纯化的融合蛋白免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞,用传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合及次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养.单克隆杂交瘤上清经ELISA双筛后,进行亚类和Western blot分析.免疫化学方法检测Survivin在肝癌中的表达情况.结果克隆了429 bp的Survivin全长基因.经ELISA双筛,获得了4株能稳定分泌针对Survivin的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类均为IgG1.Western blot结果显示,抗Survivin单抗可与MS-Survivin融合蛋白呈特异性结合.免疫细胞化学显示,该单抗与人肝癌HepG2细胞株呈阳性反应,并且可与肝癌组织结合,呈强阳性反应.结论以分子生物学技术克隆了凋亡抑制因子人Survivin基因,通过原核表达产物制备并纯化了针对Survivin的单克隆抗体,Survivin可在肝癌细胞和肝癌组织中表达,为深入研究Survivin的功能和临床检测肿瘤组织及体液中的Survivin奠定了可靠基础.
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肝癌细胞H22与树突状细胞杂交瘤苗的实验研究
目的:将肝癌H22细胞与树突状细胞(DC)相融合,研制杂交瘤苗,并观察瘤苗的生长特性、致瘤性及免疫活性.方法:将DC与肝癌H22细胞融合制备Hz2-DC融合细胞,磁式分选器分选融合细胞;观察融合细胞的生长特性和体内致瘤性;从Balb/C小鼠皮下接种融合细胞,实验设肿瘤等三组对照,每组各5只小鼠.MTT比色法检测小鼠脾CTL活性.结果:融合细胞在体外能分裂增生,但明显低于肿瘤细胞,无体内致瘤性;活融合细胞免疫的小鼠,其脾CTL杀伤H22细胞的活性明显高于对照组小鼠(P＜0.01).结论:融合细胞能诱导出特异性的CTL活性,可望成为肝癌免疫治疗的新途径.
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胃肠道特异性GDDR单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备鼠源性GDDR单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定.方法利用SEAL对GDDR氨基酸序列表位行参数评分,结合人、鼠蛋白序列同源性,设计并合成重组GDDR蛋白,并以所获得蛋白免疫BALB/c 小鼠制备鼠单克隆抗体,运用ELISA法检测抗体效价,免疫印迹分析和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果 经常规细胞融合和筛选获得两株稳定分泌抗GDDR抗体骨髓瘤细胞株,ELISA检测腹水效价达1:100 000,Western-blot 证实抗体可以和GDDR蛋白特异性结合,免疫组织化学结果显示正常胃黏膜组织GDDR表达明显高于胃癌组织.结论 成功制备出两株抗GDDR单克隆抗体mAb,为进一步研究GDDR 的生物学功能提供良好的工具.
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卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞183B2的无血清培养研究
目的建立体外无血清培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法,并进行纯化工艺的探讨,为规模化抗体生产奠定基础.方法以卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞183B2为研究对象,通过与常规的有血清培养法比较,研究了无血清培养基H-SFM中杂交瘤细胞的生长特性、抗体分泌效率、活性,用Supper-Spinner搅拌瓶进行了放大培养并用Protein A亲和层析法对无血清培养上清中抗体的纯化工艺进行了探索.结果183B2能够直接适应无血清培养基,不需要驯化;抗体生成约4 d达到高峰,抗体产量可达50 mg/L/106 个细胞,无血清培养基中细胞生长及单抗的产量与效价与有血清培养的相比没有明显差别.用1 L Supper-Spinner搅拌瓶无血清放大培养183B2细胞成功,培养上清经Protein A亲和层析纯化,蛋白产率约10 mg/L培养上清.结论本研究初步成功探索了卵巢癌单克隆抗体细胞183B2的无血清培养方法和抗体提纯工艺,为进一步大规模抗体生产提供了实验依据.
关键词： 杂交瘤 单克隆抗体 无血清培养 Protein A亲和层析 -
血清糖链抗原CA50监测大肠癌临床意义
1983年Lindholm等运用杂交瘤技术获得一种上皮恶性肿瘤细胞株,该细胞分泌的单克隆抗体命名为C50.C50抗体所识别的抗原称为CA50.C50单克隆抗体是一种抗肠腺癌细胞系的单抗,CA50以脂或脂蛋白结合的形式存在于细胞膜,属于鞘糖脂类标记物,在恶性肿瘤诊断和监测中有较好的特异性[1].文献报道CA50在胃癌、泌尿系肿瘤等方面有较大的临床实用价值[2],但在结直肠癌方面的应用尚未见报道.我们试以CA50作为结直肠癌标记物,用免疫放射测定法(IRMA)测定该类患者血清CA50含量的变化,以探讨其在结直肠癌的诊断和术后监测方面的临床应用价值.
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抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定
目的 制备抗蛋白酶体α7亚基(PBMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础.方法 以纯化的重组蛋白PBMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELSA法和Western bbt法对单克隆抗体的特性进行鉴定.结果 成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和13001.检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:128和1:256,腹水效价为1:25 600和1:32 000.两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1.Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白.结论 成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础.
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盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的:制备抗盐酸克仑特罗(clenbuterol ,CL)的单克隆抗体并进行免疫学特性鉴定.方法:用重氮化法将盐酸克仑特罗偶联于载体牛血清白蛋白(BSA),形成的结合抗原BSA-CL作为免疫原免疫BALB/c小鼠,同时将CL与卵清白蛋白(OVA)偶联制备检测原(OVA-CL).应用杂交瘤技术建立分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水并进行纯化.用竞争性ELISA法测定抗体的亲和常数及交叉反应性.结果及结论:获得了18株稳定分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,挑选其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高亲和力的细胞株进行免疫学特性鉴定.三株抗体的亚类均为IgG1.细胞上清的间接ELISA效价分别为1:1 280、1:1 000、1:800,三株腹水效价都约为1×10-6.亲和常数分别为2.4×10-8mol/L、2.83×10 -8 mol/L 、3.28×10-8 mol/L .E9-C11单抗对CL的IC50为6.1035μg/L;对沙丁胺醇的IC50大于781.25 μg/L,交叉反应性小于0.78%;对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、莱克多巴胺及部分维生素和抗生素均无交叉反应性.蛋白免疫印迹分析证明三株单抗特异性均很高,可用于与其相关的免疫检测或应用研究.
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A型肉毒毒素鼠源中和单抗的制备与鉴定
目的 制备并鉴定A型肉毒毒素(BoNT/A)鼠源中和单克隆抗体.方法 利用BoNT/AHc抗原免疫小鼠筛选得到的55株杂交瘤细胞培养上清,通过小鼠中和实验(MNA)选出中和活性较高单抗,进行抗体分型并扩增抗体可变区基因;利用BALB/c小鼠制备腹水,通过辛酸-硫酸铵以及Protein-G亲和层析纯化,并进行ELISA、SDS-PAGE、Western印迹、截短实验、BIAcore、中和活性及中和剂量分析.结果 筛选得到1株中和活性较高的小鼠单抗BAS51,其轻链为κ、重链为IgG1,获得轻、重链可变区序列;小鼠腹水效价为7.29×105,纯化抗体纯度>95％;BAS51与抗原BoNT/AHC亲和力常数为1.53×109 L/mol,可与HCC片段结合,为线性表位,中和活性为100 LD50/mg,中和剂量为66.7 LD50/mg.结论 得到1株具有较强中和活性的抗BoNT/A小鼠源单抗,为A型肉毒毒素中和抗体的研发奠定了基础.
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BTN3A3单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备BTN3A3单克隆抗体并鉴定.方法 用含小鼠IgG2a Fc标签的BTN3A3重组蛋白BTN3A3-mFc作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合获得杂交瘤细胞.用含人IgG1 Fc标签的BTN3A3重组蛋白BTN3A3-hFc作为检测原,筛选分泌BTN3A3单抗的杂交瘤细胞株.利用Western印迹法和间接免疫荧光对上述单抗进行鉴定.结果 共获得7株可稳定分泌BTN3A3单抗的杂交瘤细胞株.ELISA、Western印迹法和间接免疫荧光结果显示上述抗体可特异性地识别BTN3A3.结论 获得可应用于ELISA、Western印迹法及免疫荧光的BTN3A3单抗,为BTN3A3的功能性研究奠定了基础.
