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一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制
目的研制特异性识别人促红细胞生成素的单克隆抗体,并对其生物学特性作出初步鉴定.方法采用重组人促红细胞生成素(rhEPO)为抗原,常规免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、ELISA筛选、有限稀释亚克隆获得抗人EPO杂交瘤,以免疫印迹和快速Ig亚型分类对所获单抗作出初步鉴定.结果经筛选获得1株稳定分泌的抗rhEPO单抗的杂交瘤细胞株(1D1).亚型鉴定为IgG2b,轻链为κ链,用Western blot分析证实该单抗对rhEPO特异性识别.结论成功获得1株可分泌特异性识别rhEPO的单克隆抗体的杂交瘤.
关键词： 重组人促红细胞生成素 单克隆抗体 杂交瘤 -
抗肺炎衣原体42 kDa蛋白种特异性单抗的制备及应用
目的制备肺炎衣原体(Cpn)42kDa蛋白单克隆抗体并了解其在Cpn感染诊断中的应用价值.方法采用纯化的Cpn 42 kDa蛋白带制备出2株特异性抗Cpn 42 kDa蛋白单克隆抗体,用其中一株建立了检测Cpn的直接免疫荧光法(DFA).结果2株能稳定分泌抗Cpn单抗的杂交瘤细胞株Ad6、Db1均为IgG1,染色体数目为90～102条,效价分别为1:32768、1:16 384(微量免疫荧光法,Micro-IFA).将腹水1:100稀释,该单抗只与Cpn呈现阳性反应,与其他衣原体和呼吸道病原菌均无交叉反应.Western blot证实单抗结合Cpu蛋白的分子量为42kDa,且不与其他衣原体反应.建立的DFA对120名呼吸道感染者的咽拭子、肺泡灌洗液、痰检测,其结果和PCR试剂盒检测结果经统计学处理,二者相关系数为0.9 667,符合临床检测要求.结论DFA灵敏、准确,可用于Gpn的检测.
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鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的 制备鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法 用稳定表达B7-H4分子的L929/B7-H4转基因细胞免疫6-8周龄的Balb/c小鼠.取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,采用流式细胞术筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗B7-H4单克隆抗体的细胞株,并用Western blot和Dot blot鉴定其生物学特性.细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定T细胞增殖情况.结果 成功获得1株稳定分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C8.Western blot 和Dot blot结果表明,5C8能与人B7-H4蛋白特异性结合.CCK-8实验显示,5C8可以阻断B7-H4 分子对T细胞增殖的抑制作用.结论 成功获得鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为研究B7-H4分子在肿瘤中的作用提供了手段.
关键词： B7-H4单克隆抗体 杂交瘤 -
抗人钠碘转运体单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与初步鉴定
目的制备抗人钠碘转运体(NIS)单克隆抗体.方法以人NIS蛋白质的二个片段(第2膜外段和第14f段)为抗原免疫小鼠,运用杂交瘤技术,制备鼠抗人NIS单克隆抗体(rhNIS MAb),采用小鼠Ig亚类测定试剂条测定单抗的亚类,并通过ELISA、Western-blot、免疫组化技术等鉴定其特异性.结果运用杂交瘤技术成功地制备出能稳定分泌抗人NIS单克隆抗体的细胞系.Western-blot分析表明:此单抗所识别的靶分子的相对分子量主要在97KD,免疫组化染色显示:甲状腺滤泡细胞基底膜上有棕黄色着色.结论成功地制备出抗人NIS单克隆抗体,为NIS抗原-抗体的研究提供了新的工具,NIS单克隆抗体不仅可以应用于甲状腺、乳腺等领域的基础研究,而且可以用于临床,为甲状腺疾病的诊断和治疗提供切实保障.
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肺炎支原体种特异性单克隆抗体杂交瘤制备及鉴定
目的制备抗肺炎支原体种特异性单克隆抗体.方法以纯化的肺炎支原体膜蛋白抗原(相对分子质量为43×103)加福氏免疫佐剂免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 Ag14融合,以酶标记免疫吸附测定法(ELISA)筛选和鉴定所制备的单克隆抗体.结果共筛出3株分泌抗肺炎支原体种特异单克隆抗体杂交瘤,经免疫鉴定其分泌的免疫球蛋白类型为IgG1、IgG2a及IgM,与肺炎支原体有很强的亲和力,与种属相近的其它6株支原体没有交叉反应.结论本次筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌高浓度的肺炎支原体单克隆抗体,并且有很强的种特异性.
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重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备
目的:制备重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC)鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素( Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础.方法:IPTG诱导含pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠.SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果.采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC 单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养.采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型, ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性.结果:将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经 ELISA检测,血清有效稀释度达1:12800.共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7 和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应.结论:本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型.
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金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ单克隆抗体的制备和鉴定
目的:制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ(SEI)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定.方法:以SEI蛋白免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,经ELISA检测筛选及3次有限稀释,获得目的杂交瘤细胞株;采用杂交瘤细胞免疫小鼠,制备并纯化了单克隆抗体,并对所获得的单克隆抗体进行性质鉴定.结果:终获得了两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞8F7与D8,两者分别为IgG2b型与IgG1型;亲和常数分别为9.215×108 L·mol-1和1.968×1010 L·mol-1;两者均有较强的特异性,与纯化的SEG、SEE、SEC及金黄色葡萄球菌上清液均未有交叉反应;相加实验表明两个单克隆抗体识别的为相同表位.结论:单克隆抗体的成功制备,为初步建立肠毒素SEI的双抗夹心测定方法奠定了基础.
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抗人类癌抗原单克隆抗体的制备与肝组织中的鉴定
目的 运用杂交瘤技术制备人类癌抗原(Human carcinoma antigen,HCA)的IgG单克隆抗体.方法 用现有的HCA-IgM抗体HAE3分别从PC3、PCaT及LCaT总蛋白中分离纯化得到三组糖蛋白复合物组分作为抗原分别免疫Balb/c小鼠,获得鼠抗人HCA抗体.并对这些抗体进行ELISA检测效价、western-blot以及免疫组化等分析,筛选合适的抗体进行下一部分研究.结果 共制备出62株高亲和力、高特异性并且针对不同抗原结合位点的鼠抗人HCA单克隆抗体.通过在肝组织上的鉴定,发现这些抗体无论效价、western-blot以及免疫组化都适合进行进一步研究.结论 我们利用天然HCA抗原制备了高亲和力,高特异性并且针对不同抗原结合位点的单克隆抗体,为我们进一步研究其结构及功能提供了有力的特异的工具.
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人巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定
目的制备具有中和人巨细胞病毒(HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生物学活性鉴定.方法用HCMV抗原免疫Balb/c小鼠5、6次后,取致敏的脾脏B淋巴细胞和HGPRT-SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,间接ELISA法筛选克隆.挑取分泌抗体的杂交瘤株,再用间接ELISA进行鉴定,终获得抗HCMV的阳性杂交瘤细胞株,用Ouchterlony法鉴定McAb的亚类.小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞,取腹水经盐析法提纯IgG.Lowry法测定蛋白质浓度,在第6代HF细胞株及原代培养新生乳鼠脑神经细胞上进行微量中和实验.结果获得了4株杂交瘤细胞株,制备的F9McAbs盐析后蛋白质浓度为11.2 g/L,血清学试验证明该McAbs能和HCMV抗原进行特异性结合,制备的IgG具有高度特异性.且体外实验已证实,该McAb具有中和抗体的性质.结论通过杂交瘤技术制备的HCMV单克隆抗体能在体外中和HCMV致病变效应,为该McAb作为抗人巨细胞病毒治疗药物的研发奠定了基础.
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抗细粒棘球绦虫成虫单克隆抗体的制备及鉴定
目的建立能分泌与细粒棘球绦虫(简称包虫)成虫特异结合的抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株.方法用包虫成虫抗原免疫BALB/c小鼠后,获取免疫的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合.结果 ELISA方法筛选出1株能持续稳定分泌抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株,1F5E3C9E9D5杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以与包虫成虫、棘球蚴结合,与囊液抗原呈边缘性阳性反应,而与泡球蚴EM2抗原呈阴性反应.冻存1个月后复苏,仍能稳定分泌.经免疫组织化学检测发现,该单克隆抗体与棘球蚴的生发层,棘球蚴原头节虫体呈阳性反应.结论 1F5E3C9E9D5是一株稳定的杂交瘤细胞株,所分泌的抗细粒棘球绦虫成虫单克隆抗体在粪抗原的检测方面有应用前景.
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抗重组人内皮抑素单克隆抗体的制备
目的 用重组人内皮抑素融合蛋白作为抗原,制备鼠抗人内皮抑索单克隆抗体.方法 采用麦芽糖结合蛋白理组内皮抑素(MBP-endostatin)免疫Balb/c小鼠,取其脾脏与同系骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过酶联免疫吸附试验(EUSA)筛选阳性克隆.结果 经2次亚克隆后获得一株阳性的杂交瘤细胞.结论 抗人内皮抑素单克隆抗体的制备为肿瘤治疗的基础研究及检测奠定了基础.
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ODC单抗的制备及其在大肠癌检测中的应用
目的:制备鸟氨酸脱羧酶(ODC)单克隆抗体并观察其在大肠癌检测中的意义.方法:以人ODC重组蛋白免疫小鼠,用杂交瘤细胞技术制备单克隆杂交瘤细胞,以ILISA和Westernblot法验证阳性单克隆细胞所间生的免疫球蛋白.免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达水平.结果:筛选出稳定分泌抗ODC单抗的细胞株,ELISA检测证明其所分泌单抗属于1gG2a型.免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达显示该单抗检测效果较好,大肠癌组织中ODC的表达水平明显高于正常组织(P＜0.05).结论:成功地制备出ODC单克隆抗体,为进一步研究ODC基因表达与大肠癌的发病机理及其诊断的关系打下了良好基础.
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双特异性单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用
双特异性单克隆抗体(BsMAb)是含有两个不同配体结合位点的免疫球蛋白分子,在疾病的诊断治疗上具有较大临床应用潜力,特别在肿瘤治疗方面,有其不容忽视的优越性.现综述近年来BsMAb在肿瘤治疗中的研究及应用进展.同时,对其人源化进程也进行了概述.
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淋球菌MtrC融合蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和特性鉴定
目的:建立针对淋球菌MtrC膜蛋白的单克隆杂交瘤细胞株,制备相应的单克隆抗体(单抗),用于淋球菌耐药机制的研究和淋球菌耐药的临床检测.方法:用重组MtrC抗原免疫6周龄Balb/c小鼠,按常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单抗.应用间接ELISA法和Western印迹法分别测定单抗亚类及其特异性.结果:建立了2株小鼠抗MtrC单抗杂交瘤细胞2B3和4F7,染色体数在95～103之间,能稳定分泌抗MtrC单抗,单抗类型为IgG1,腹水效价为1∶105和1∶106.结论:本研究建立的单抗在检测淋球菌MtrC膜蛋白时有高度特异性和敏感性.
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人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定
目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.
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IL-6、IL-8及其在烧伤感染中的作用
白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)是由多种细胞产生,并且具有多种生物学功能的重要细胞因子.虽然发现它们的时间很短,但近年来的研究表明,IL-6能诱导B细胞的终末分化,刺激浆细胞瘤和杂交瘤的生长,诱导肝细胞产生急性期蛋白质[1],刺激造血干细胞,刺激T细胞和胸腺细胞[2];IL-8能趋化和激活中性粒细胞[3],趋化嗜碱性粒细胞和释放组胺,促进T淋巴细胞参与免疫应答作用,增加内皮细胞的通透能力.IL-6、IL-8是烧伤病理生理过程中重要的细胞因子.
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抗粉螨Ⅰ类变应原单克隆抗体细胞株的建立与鉴定
目的 建立粉螨Ⅰ类变应原(dermatophagoides farinae I,Derf Ⅰ )杂交瘤细胞株,并对其分泌的Der fⅠ单克隆抗体进行鉴定.方法 用重组Der fⅠ蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和3次克隆化,制备出单克隆抗体,Western blot法确定单克隆抗体的丙种球蛋白特异性,对单克隆抗体进行鉴定.结果 获得2株可稳定分泌高效价DerfⅠ单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Western blot试验证明2株单抗与Der fⅠ蛋白均有特异性反应.结论 成功制备2株抗Der fⅠ的单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力.
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白喉类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的:制备并鉴定白喉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,为白喉的快速检测及致病机制的研究提供有力的抗体工具.方法:用白喉类毒素做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度针对白喉类毒素的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接ELISA和Western-blot检测单克隆细胞株的特异性.结果:通过细胞融合和克隆化,筛选出3株持续分泌抗白喉类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E12、1E11、1G10.间接ELISA和Western-blot检测结果表明1E12、1E11、1G10可以和白喉类毒素发生特异性反应.结论:成功制备了抗白喉类毒素单克隆抗体,为制备免疫诊断试剂盒和抗体药物的开发奠定了基础.
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树突状细胞与细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应
目的研究树突状细胞与小鼠肥大细胞瘤细胞P815融合作为肿瘤疫苗免疫小鼠后抑制肿瘤生长的作用及其机理.方法Balb/C小鼠DC与P815细胞体外融合,形成的杂交瘤分2次免疫接种同基因小鼠皮下,然后用P815细胞攻击免疫的小鼠,观察肿瘤的生长情况及免疫小鼠脾细胞特异性CTL功能.结果DC-P815融合率为30%,杂交瘤接种小鼠能产生明显的抗肿瘤效应,其拮抗P815细胞攻击的能力明显强于用灭活的死P815细胞与DC混合,和单用死亡P815细胞免疫的小鼠及用生理盐水的对照组小鼠.DC-P815杂交瘤免疫接种小鼠的脾细胞特异性CTL,杀伤活性强于其它各组小鼠.结论DC与肿瘤细胞融合后作为肿瘤疫苗接种可在体内产生明显的抗肿瘤免疫,其机理主要是特异性CTL的作用.
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次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型产抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选
目的 筛选次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)敏感型产抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体杂交瘤细胞株,为双特异性抗体的制备作好准备.方法 在培养瓶中培养产抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体杂交瘤细胞株H6,取长到对数生长期的细胞,加入1.25 μg/ml的8-氮鸟嘌呤,继续培养,当细胞长到60％左右时,弃去一部分细胞,加入2.5 μg/ml的8-氮鸟嘌呤,继续培养,重复以上操作,倍比提高8-氮鸟嘌呤的含量,直至8-氮鸟嘌呤浓度达到20μg/ml,取细胞上清ELISA检测其产抗体情况.结果 成功诱导筛选到HAT敏感的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型杂交瘤细胞6株,均能分泌抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体.结论 该方法能成功筛选HAT敏感型抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体杂交瘤细胞.
关键词： 8-氮鸟嘌呤 次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT) 杂交瘤
