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肝脏疾病干细胞治疗研究进展
各种类型的干细胞以其独特的模式在肝脏再生中发挥作用,这在许多报道中均已阐述.本文对当前广泛讨论的多种干细胞群体加以描述,试图将有关肝干细胞生物学方面不同的观点加以概括.本文重点阐述了用"细胞融合"而非"转分化"理论来解释肝脏再生的观点.并且认为在尝试干细胞对肝脏疾病进行临床治疗之前,尚有一系列未明确的问题需要进一步研究.
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活化B淋巴细胞与人骨肉瘤融合的制备及其对体外免疫原性的影响
目的:研究人骨肉瘤抗原进入提呈细胞的有效途径和方法,探索筛选制备人骨肉瘤与活化B淋巴细胞融合痛的方法,并研究其体外免疫原性和作为人骨肉瘤免疫疫苗的可能性,为进一步临床应用做有意义的前期实验.方法:抗人Ig-M、金黄色葡萄球菌A蛋白及少量IL-2和PMA活化的人脾脏来源B淋巴细胞,以500mg/ml聚乙二醇为融合剂,使骨肉瘤细胞与活化B淋巴细胞进行化学融合,贴壁后去除未融合淋巴细胞,特异性抗B细胞抗体预包被平板捕捉与B细胞融合的骨肉瘤.条件培养基体外筛选扩增,检测融合效率.紫外线灭活,同时设单纯灭活的未融合骨肉瘤组作为对照,记数法测量各组刺激淋巴细胞增殖能力,各组培养所得淋巴细胞进行体外杀伤实验(效靶比50:1),改良MTT法测量淋巴细胞对亲源之骨肉瘤细胞的杀伤指数.结果:人B淋巴细胞体外激活后可以与人骨肉瘤细胞化学融合,可利用贴壁性质和特异性B淋巴细胞抗体等方法部分纯化融合细胞并适当扩增浓集.融合细胞于3周和4周表达B淋巴细胞的标志性抗原效率分别为60.6%和45.4%.紫外线灭活融合瘤明显提高其体外刺激淋巴细胞增殖能力(p＜0.01),诱发淋巴细胞对亲源骨肉瘤细胞的杀伤作用(11.60%且P＜0.01).结论:利用人骨肉瘤细胞和活化B淋巴细胞可以制备融合瘤,融合瘤显著提高亲源骨肉瘤的体外免疫原性,引发体外抗瘤免疫.这提示利用细胞融合方法快速构建人骨肉瘤与B细胞融合瘤的瘤苗方案也是简便有效的,可能成为现实的个体化肿瘤疫苗新方案.
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肿瘤干细胞的研究进展
目前,越来越多的证据表明肿瘤干细胞对肿瘤发生和发展起着至关重要的作用.肿瘤干细胞理论也被广泛接受,并对肿瘤发生、侵袭性生长、复发和转移以及治疗新策略发展提供了新观点.随着对肿瘤干细胞生物学研究的深入,必将为肿瘤的诊治提供帮助.现将肿瘤干细胞的理论与模型、肿瘤干细胞的起源和分类的新研究进展阐述如下.
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尼帕病毒F糖蛋白在重组牛痘病毒中的表达及鉴定
尼帕病毒(NiV)F蛋白在病毒侵入细胞和诱导中和抗体等方面具有重要作用.通过over-lapping PCR合成密码子优化的F蛋白基因构建了表达NiV F蛋白的重组牛痘病毒(WR株)rWR-NiV-F.利用兔抗NiV血清为检测抗体,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了F蛋白在重组病毒感染细胞中的表达.SDS-PAGE和Western blot检测证明重组蛋白F0被裂解为F1和F2.以rWR-NiV-F感染瞬时转染共表达NiV受体结合囊膜糖蛋白G的BHK细胞,可诱导细胞膜融合及合包体形成,证明该重组病毒表达F蛋白保持良好的抗原性及生物学活性,为NiV诊断及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础.
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新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析
为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况.结果表明, NDV F 第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响.R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%.细胞表面表达效率没有明显的改变.N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变.L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要.细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%).D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题.当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%.说明 NDV F分子上与 HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量.
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人副流感病毒3型HN糖蛋白N-糖链的功能研究
为了研究人副流感病毒3型(hPIV3) HN糖蛋白N-糖链的功能,采用基因定点突变技术构建糖基化位点突变体,然后检测各突变株的蛋白电泳速率、细胞表面表达量、受体结合活性、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性.HN分子的G1、G2、G3和G4 4个糖基化位点分别和联合突变后发现G1、G2和G4及其联合突变株(G12、G14、G24和G124)电泳速率加快,而G3突变株电泳速率没有变化.各突变株的表达效率,神经氨酸酶活性与野毒株相比差别无统计学意义(P＞0.05),但受体结合活性和促细胞融合活性均有不同程度的降低(P＜0.05).G1、G2和G4位点突变后受体结合活性分别为突变前的83.94％、76.45％和55.32％,而促细胞融合活性降为突变前的80.84％、77.83％和64.16％.联合突变株G12、G14、G24和G124血吸附活性进一步降低,为突变前的33.07％、20.67％、19.96％和15.11％,促细胞融合活性进一步降低为突变前的46.36％、12.04％、13.43％和4.05％.结果表明:hPIV3 HN糖蛋白的糖链对HN糖蛋白的受体结合活性和促细胞融合活性有重要影响,推断糖链的丢失可能会引起HN糖蛋白头部结构(受体结合活性位点所在区域)或者方向的改变或者无法与宿主细胞膜表面的凝集素受体(一种与N-糖链结合的受体)结合,进而导致受体结合活性和促细胞融合活性的降低.
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猫疱疹病毒1型分子生物学研究进展
猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus-1,FHV-1)是引起猫科动物以上呼吸道感染和眼部溃疡为主要特征的猫传染性鼻气管炎的病原.该病毒在全球范围内流行,对宠物猫及虎、豹等野生猫科动物的健康造成了严重的威胁.本文介绍了FHV-1的基因组结构、编码蛋白及其生物学功能、病毒融合宿主细胞机制,以期为该病致病机制的深入研究与防控策略的制定提供参考.
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糖化作用对新城疫病毒HN糖蛋白功能的影响
为了研究糖化作用对新城疫病毒(NDV)HN糖蛋白生物学活性的影响,特别是对HN促细胞融合作用的影响,采用基因定点突变技术分别去掉HN分子上的4个糖化位点,然后检测各突变株的细胞表面表达情况、受体识别特性、神经氨酸酶活性、促细胞融合作用、免疫沉淀特性等.结果表明,将野毒株NDV HN的细胞表面表达效率定为100%时,D198R-HN突变株的表达效率为82.6%;而对二者的G1、G2、G3和G4 4个糖化位点分别进行定点突变时,得到8种突变株.它们的表达效率均有不同程度的降低,D198R-HN-G2和D198R-HN-G4两种突变株与D198R-HN相比更为明显.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变株的受体识别活性分别为突变前的47.95%、68.49%、42.67%和41.10%;而D198R-HN突变株的G1、G3和G4突变株的受体识别活性突变前后变化不明显,只有D198R-HN-G2突变株的受体识别活性得以恢复较多,从原来的10.96%恢复到32.88%.野毒株HN突变后神经氨酸酶活性普遍降低,尤以G4影响明显,仅为野毒株的9.60%;而D198R-HN突变株突变后神经氨酸酶活性普遍升高,尤以G2恢复高,由原来的0.45%恢复到7.59%.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变前后细胞融合情况变化不大;而D198R-HN的G1、G2、G3和G4突变后,D198R-HN-G1、D198R-HN-G3、D198R-HN-G4没有变化,但D198R-HN-G2使D198R-HN的细胞融合活性得以恢复30.90%.野毒株HN电泳时呈现1条较宽的泳带,当突变掉1个糖化位点时,泳动速度加快.D198R-HN突变株及D198R-HN-G1、D198R-HN-G3和D198R-HN-G4 HN突变株电泳时,呈现两条模糊不清的条带.但D198R-HN-G2突变株HN电泳时,其条带变得窄而锐利,且泳动速度快.上述结果说明糖链能影响HN的表达或从细胞浆运输到细胞表面,G2对HN的受体识别活性影响较大,推测G2糖链部分结构的改变影响到了HN G2周围的表型特性,从而导致神经氨酸酶活性、促细胞融合作用的改变.
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副粘病毒融合蛋白活性位点中亮氨酸基因突变分析
为了确定副粘病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中亮氨酸在F的细胞融合作用中的作用,弄清F融合细胞的分子机理,采用基因定点突变法创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并在真核细胞内进行表达,Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率.结果表明,hPIV3 F第460位亮氨酸(L)和第474位异亮氨酸(I)分别突变成丙氨酸(A)(L460A和I474A)时,细胞融合功能分别只相当于野毒株的51.24%和48.73%;而第467位L和第481位L分别突变成A(L467A和L481A)时,细胞融合功能则无明显改变;当第460和467位L同时突变成A(L460A～L467A)时,细胞融合功能降低了79.13%;而第474位I和第481位L同时突变成A(I474A～L481A)时,细胞融合功能无明显改变.NDV F第481位L和第488位L分别突变成A(L481A和L488A)时,细胞融合功能分别降低了75.22%和80.04%;将二者共同突变时,则进一步降低,只有野毒株的10.13%.各突变株的表达效率没有改变.说明F分子上与HN相互作用的特异性区域中的亮氨酸在细胞融合中发挥着重要作用,即hPIV3F第460位L和第474位I,NDV第481和488位L,突变后细胞融合作用不同程度下降.
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抗NPM1单克隆抗体的制备
目的 制备并鉴定NPM1单克隆抗体.方法 利用纯化的NPM1融合蛋白作为抗原,通过常规的细胞融合技术制备杂交瘤细胞,用间接ELISA法筛选能出产生抗NPM1单克隆抗体的阳性细胞株,对抗NPM1单克隆抗体的特性进行分析.结果 筛选出1株产生抗NPM1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,产生的抗体为IgGl亚类,效价达1∶720000;纯化后经SDS-PAGE显示两条蛋白条带,纯度达95％以上,相对分子质量约为50000和25000,与单一抗体重链、轻链分子大小相符.免疫组化证实,纯化的2G7抗NPM1单克隆抗体可检测出NPM1在结直肠癌表达,阳性位点为细胞核.结论 制备的抗NPM1单克隆抗体可用于NPM1蛋白功能的研究与临床检测.
关键词： 核仁磷酸化蛋白NPM1 单克隆抗体 细胞融合 结直肠癌 -
诱导多能性干细胞与心肌细胞的融合细胞遗传表型特征研究
目的 体外构建诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的融合细胞,探讨其细胞遗传学以及定向分化等生物学特点.方法 iPSCs与原代心肌细胞通过聚乙二醇(PEG-4000)诱导融合,检测融合细胞染色体数分布情况,融合细胞碱性磷酸酶染色,鉴定亲本细胞特异性基因和蛋白在融合细胞中的表达情况,以及当融合细胞失去亲本心肌细胞表型时,其向心肌细胞分化的能力.结果 融合细胞表现为iPSCs样的特点;融合细胞主要表现为四倍体或者近似四倍体的核型(超过75%的融合细胞染色体数目在76~80条之间);碱性磷酸酶的阳性率低于同时间点的iPSCs;干细胞特异性基因Oct-4和Nanog的表达量在融合细胞与iPSCs中没有差异,而心肌细胞特异性基因α-MHC和β-MHC在融合细胞中的表达量明显低于心肌细胞;Oct-4蛋白在不同代数的融合细胞中均有表达,而随着时间的延长,cTnT蛋白逐渐呈阴性表达;失去亲本心肌细胞表型的融合细胞能够向心肌细胞分化,且分化率高于同时间点的iPSCs.结论 iPSCs与原代心肌细胞的融合细胞,初期表现出双向重建,P5代后完全表现出干细胞显型,并且能向心肌细胞分化.
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细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力
目的 研究细胞融合在黑色素瘤细胞增殖中的作用及其分子机制.方法 用聚乙二醇细胞融合方法融合黑色素瘤细胞,通过流式分选获得稳定的融合细胞.体外培养及细胞计数检测融合细胞的增殖速度.Affymatrix基因芯片分析差异表达的基因,IPA软件进行基因功能分析.Western blot检测细胞蛋白.结果 PEG化学融合法成功获得稳定的黑色素瘤融合细胞,其体外增殖速度明显减慢(P＜0.01).黑色素瘤融合细胞与增殖相关的PI3K-AKT通路明显下调(P＜0.01).融合细胞phospho-S6蛋白表达明显降低.结论 细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力.
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树突状细胞-肿瘤细胞之融合细胞在抗肿瘤免疫中的研究进展
树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内的专职抗原呈递细胞,具有活跃地摄取、处理抗原的能力,并表达高水平的MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原和CD80、CD86等共刺激分子,因而能有效地向T细胞呈递抗原、激发初次细胞免疫应答[1].肿瘤融合细胞可用于免疫治疗,早由Cohen[2]报道,他发现某些弱免疫原性肿瘤的肿瘤相关抗原(tumourassociated antigen,TAA)在融合的肿瘤细胞中免疫原性显著提高.随着对肿瘤细胞融合特性研究的深入以及树突状细胞的发现,使肿瘤学家逐渐将研究重点转向利用抗原呈递细胞(尤其是DC)和肿瘤细胞的融合细胞疫苗来诱导抗肿瘤免疫.1994年Guo[3]等报道,将大鼠B细胞和大鼠肝癌细胞融合,用获得的融合细胞免疫荷瘤大鼠,可以使大鼠体内大部分肿瘤消退,并能抵抗再次注射同型肿瘤的攻击.该研究为肿瘤疫苗研究提供了全新视角.我们仅就DC-肿瘤细胞之融合细胞的制备方法、纯化方法以及近几年的抗肿瘤研究进展作一综述.
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白血病复发的机制:老问题,新视角
复发是根治白血病的瓶颈,困扰了几代血液学工作者.21世纪初人类微生物基因组计划(Human Microbiome Project,HMP)的研究进展表明,人体是以人类细胞为核心与共生微生物共同构成的超有机体;对内源性逆转录病毒和朊病毒蛋白(prion protein,PrP)的逐步阐明提示了共进化微生物对人类健康的可能影响;近年来对隧道纳米管道(tunneling nanotubes,TNT)在细胞间通讯和物质传递中作用的初步阐明提示了癌基因、癌蛋白在细胞间传播的新途径;以及对体内细胞融合作用和意义的深入探讨及供体细胞白血病的报道等多方面的研究进展,为白血病复发机制的研究提供了新的视角.作者结合多年来的工作从新的视角探讨影响白血病复发的可能机制,提出存在微小残留病和细胞间致癌因子传递两类复发机制的假设.
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肿瘤转移抑制基因Kai1的研究状况
随着分子生物学的深入研究,人们对肿瘤发生的分子基础有了明确的认识.然而,对威胁肿瘤患者生存的主要原因--肿瘤转移的分子基础却了解较少.目前已知,肿瘤转移与肿瘤发生一样,不仅有促进基因的激活,还伴有抑制基因的失活.肿瘤转移抑制基因的存在是在细胞融合实验中证实的.鼠前列腺癌细胞系AT3.1具有高转移特性,AT2.1则是非转移的,两种细胞融合后,得到的细胞仍然保持肿瘤细胞的特点,却不具备高转移特性.将人的第11号染色体转移到鼠高转移的前列腺癌细胞系AT6.1中,也观察到相同的结果,提示有转移抑制基因定位于该染色体.1995年,Dong等[1]自转移到AT6.1细胞系中的人第11号染色体中分离到特异性抑制肿瘤转移的基因,命名为Kai1(取自中文抗癌kang ai)基因.
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福建省HIV-1感染者病毒的分离
目的对HIV-1感染者进行病毒分离.方法采集福建艾滋病病毒感染者肝素抗凝血10份,分离外周血单核细胞(PBMC),用共培养方法分离HIV,用P24抗原ELISA试剂盒做检测.结果分离到9株HIV-1,分离率达90%,将其中的4株感染MT4细胞,均可引起细胞融合.3株表现为一过性感染MT4细胞,属慢/低病毒,1株为持续性感染MT4细胞,已传至15代,属快/高病毒.结论成功分离到HIV-1病毒.
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人副流感病毒3型HN糖蛋白受体结合位点中保守氨基酸突变分析
目的 研究人副流感病毒3型(hPIV3) HN受体结合位点中保守氨基酸功能.方法 采用定点突变与同源重组相结合方法将HN受体结合位点中的7个保守氨基酸突变为丙氨酸(A),分别为R192A、D216A、E409A、R424A、R502A、Y530A和E549A,各突变株在BHK-21细胞内表达并测定其免疫沉淀反应、蛋白表达效率、促细胞融合、受体结合和神经氨酸酶活性.结果 各突变株在BHK-21细胞内折叠加工正常并成功转运到细胞膜,其膜表面蛋白表达率与野毒株相比差别无统计学意义;各突变株促细胞融合活性不同程度下降,R502A降低多,为野毒株的14.2％;各突变株受体结合活性也不同程度降低,突变株吸附豚鼠红细胞与吸附人红细胞的能力大体一致;各突变株神经氨酸酶活性变化程度不同,R502A下降多,为18.6％;E549A下降少,为94.9％.结论 hPIV3HN蛋白受体结合位点中的保守氨基酸对HN的促细胞融合活性有重要作用,第502位精氨酸(R)是关键氨基酸.
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用指示基因法定量分析副粘病毒包膜糖蛋白所致的细胞融合
目的建立一种定量分析副粘病毒包膜糖蛋白融合细胞功能的方法。方法 将Vtf\|7重组痘苗病毒感染BHK21细胞后，分别转染待测基因DNA和Pg1nt7 β-gal DNA，16h后将两个细胞群混合，37 ℃ 15 h后用NP-40裂解细胞，取上清进行显色反应，在SOFTMAX软件支持下用ELISA自动测定仪在570 nm 测吸光度A值。结果 指示基因法与细胞计数法有密切相关关系，r=0.9890(P＜0.01)；与面积判断法的符合率达100%。佳主要反应条件包括：16 mmol/L底物浓度；显色反应20～25 min；1 μgDNA转染量；每种细胞群接种1×105个。结论 指示基因法是一种非常敏感、特异、可重复性好的细胞融合定量分析方法，可用于副粘病毒细胞融合作用功能的研究，并可作为其他病毒细胞融合作用研究的参考，具有较大的推广应用价值
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人胶质瘤细胞系 SU3与小鼠巨噬细胞共培养产生的融合细胞具有恶性转化的特点
目的：通过胶质瘤细胞（SU3）与巨噬细胞（macrophage，Mφ）共培养来证明胶质瘤间质中的Mφ恶性转化是SU3与Mφ融合导致的。方法将转有红色荧光蛋白基因（ RFP）的SU3与表达增强型绿色荧光蛋白（ EGFP ）的小鼠腹腔冲洗出的Mφ进行体外共培养；用单克隆方法建立表达RFP＋/GFP＋双色荧光（黄色）的细胞系，然后进行癌细胞相关表型分析、致瘤性试验、鼠巨噬细胞标记物检测。结果（1）这两种细胞共培养后，细胞群中出现为数不多的黄色细胞，并成功单克隆到C3、C4和C12三株细胞。（2） C12继续传代培养后分化出RFP＋、EGFP＋和RFP＋/EGFP＋三种类型细胞，但随着传代次数增多，EGFP＋（绿色）细胞比例逐渐升高而成为主体，RFP＋/EGFP＋（黄色）细胞比例逐渐下降并维持在较低水平，而RFP＋（红色）细胞基本消失。（3） C12细胞株中的EGFP＋细胞具有以下特点：生长接触抑制消失、增殖速度快、染色体异倍体等癌细胞特征；在裸小鼠体内具有高致瘤率（5/5）；表达巨噬细胞特异性标记CD68，大部分染色体为鼠端着丝粒。结论本实验用体外模型证明我们先前在实体瘤中观察到的人脑胶质瘤细胞诱导宿主巨噬细胞恶性转化是通过细胞融合途径实现的。本实验与我们先前从荷瘤鼠实体瘤组织中克隆到恶性转化的巨噬细胞株（ ihCTC）的体内实验一起，相互印证了肿瘤微环境中宿主巨噬细胞恶性转化是客观存在的。宿主细胞与肿瘤细胞融合后发生的恶变既为肿瘤恶性进展和肿瘤异质性增添了新的内涵；又为肿瘤靶向治疗增加了新的靶标。
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汉坦病毒GM04-38株N-联糖基化位点在细胞融合中作用的初步确定
段外,各突变体均表达出G1、G2片段.IFA显示天冬酰胺突变前后各位点均显示荧光信号,呈核周分布.突变后134位点与928位点的突变体融合现象消失,其余各位点突变后融合现象仍然存在.结论 G1上的134位点可能与蛋白正确折叠有密切关系,134位点突变极可能导致蛋白的错误折叠,进而无法转运出内质网.G2上的928位点对细胞融合有重要作用,提示汉坦病毒融合肽很有可能位于G2上.
