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诱导多能性干细胞与心肌细胞的融合细胞遗传表型特征研究
目的 体外构建诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的融合细胞,探讨其细胞遗传学以及定向分化等生物学特点.方法 iPSCs与原代心肌细胞通过聚乙二醇(PEG-4000)诱导融合,检测融合细胞染色体数分布情况,融合细胞碱性磷酸酶染色,鉴定亲本细胞特异性基因和蛋白在融合细胞中的表达情况,以及当融合细胞失去亲本心肌细胞表型时,其向心肌细胞分化的能力.结果 融合细胞表现为iPSCs样的特点;融合细胞主要表现为四倍体或者近似四倍体的核型(超过75%的融合细胞染色体数目在76~80条之间);碱性磷酸酶的阳性率低于同时间点的iPSCs;干细胞特异性基因Oct-4和Nanog的表达量在融合细胞与iPSCs中没有差异,而心肌细胞特异性基因α-MHC和β-MHC在融合细胞中的表达量明显低于心肌细胞;Oct-4蛋白在不同代数的融合细胞中均有表达,而随着时间的延长,cTnT蛋白逐渐呈阴性表达;失去亲本心肌细胞表型的融合细胞能够向心肌细胞分化,且分化率高于同时间点的iPSCs.结论 iPSCs与原代心肌细胞的融合细胞,初期表现出双向重建,P5代后完全表现出干细胞显型,并且能向心肌细胞分化.
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非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究
诱导多能性干细胞(iPSC)技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用.非整合质粒(Episomal)方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用.本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞(CB MNC)重编程为诱导多能性干细胞(iPSC),建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础.利用CB MNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episomal方法进行优化.结果表明:CB MNC采用红系培养液,培养8d,使用启动子为SFFV (spleen focus forming virus)的Episomal载体,在低氧(3％)条件下诱导,CB MNC重编程效率高,可达到0.12％.通过分析佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36+ CD71+ CD235alow的有核红细胞是重编程主要的供体细胞来源.结论:本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术.
关键词： 诱导多能性干细胞 脐血 单个核细胞 Episomal载体 非整合 -
建立非基因整合原发性骨髓纤维化诱导性多能干细胞株
目的:利用诱导多能性干细胞(iPSC)技术建立原发性骨髓纤维化(PMF)诱导多能性干细胞系,为研究血液病的发生发展提供一个实验模型.方法:采用非基因整合型质粒重编程携带JAK2 V617F突变的PMF患者骨髓来源的单个核细胞,诱导生成该患者特异的iPS细胞株.结果:采用此方法建立的iPS细胞株,在体外能够稳定传代,无外源性基因整合,多能性基因表达水平与人胚胎干细胞类似,在体内具有形成三胚层结构的能力.测序结果显示,所建立的患者的iPS细胞株携带不同负荷的JAK2V617F突变.结论:成功地建立非基因整合的PMF患者特异的iPS细胞株,这为研究PMF的发病机制、化疗药物筛选及实现精准化治疗提供了一个重要的疾病模型.
关键词： 诱导多能性干细胞 原发性骨髓纤维化 非整合 Episomal载体 -
长链非编码RNA-ROR功能的研究进展
在人类基因组中,存在大量的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs).近年来随着研究的发展,这些ncRNA已成为继microRNAs和siRNAs之后又一研究热点.长链ncRNA-ROR(large intergenic ncRNA-regulator of reprogramming,lincRNA-ROR),是新发现对细胞重编程过程具有重要调控作用的长链非编码RNA.现有的研究表明,ROR在诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)形成、DNA损伤、氧化应激等过程中发挥重要的作用;此外,在肿瘤中,目前发现ROR与乳腺癌、肝癌的发生、转移等密切相关.ROR拥有丰富的生物学功能,但其具体的作用机制尚不明确,本文就ROR的研究背景、发现过程、功能及特点做一概述,对其在肿瘤上的作用及相关调控机制的进行探讨.
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诱导多能性干细胞在心脏疾病领域的研究和应用
诱导多能性干细胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs）是一种类似于胚胎干细胞（ embryonic stem cells， ESCs）的、具有自主增殖和分化能力的多能性干细胞。 iPSCs可以由各种不同动物的不同体细胞重编程转化而来，能增殖并分化成各种体细胞，其中包括具有收缩和兴奋功能的心肌细胞。截止目前，iPSCs分化的心肌细胞主要用于以下几个方面：通过细胞移植治疗缺血性心肌病及心肌梗死；在体外建立遗传性心脏病模型，研究其发病机制；检测药物心脏毒性，筛选患者特异性个体化药物；构建心脏生物起搏器。
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ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.
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细胞重编程前后基因组的动态稳定性
背景：研究表明，人类早代诱导多能性干细胞发生拷贝数变异多于晚代、体细胞及人类胚胎干细胞。目的：分析重编程过程是否危及基因组稳定性，进一步探讨诱导多能性干细胞建系的有效性。
方法：利用高分辨率的Affymetrix Cytoscan HD芯片检测遗传性癫痫先证者的体细胞及早代诱导多能性干细胞，分析重编程后基因组拷贝数变异及杂合性缺失的变化。
结果与结论：与遗传性癫痫患者体细胞相比，其早代诱导多能性干细胞的杂合性缺失未发现明显差异，而存在更多的拷贝数变异，且均为微重复，涉及致癌基因。结果证明重编程过程中基因组稳定性动态变化，需要动态监测诱导多能性干细胞保证其基因组稳定性及临床安全性。 -
诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立
背景：目前，大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立，但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。
目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。
方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞，获得了诱导多能性干细胞；在诱导分化体系中添加了 Y-27632，克服干细胞扩增中的凋亡现象；运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。
结果与结论：①前3代细胞克隆传代时，诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多，很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂，能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下，经过体外诱导分化，形成CD34+造血祖细胞。 -
拷问诱导多能性干细胞的应用前景
诱导多能性干细胞(iPS细胞)是指通过特定基因的表达将完全分化的成年细胞重新编程为类似胚胎状态的全能性或多能性的细胞.2006年,日本的Yamanaka研究小组首次报道利用逆转录病毒将4种转录因子组合导入已分化的小鼠纤维母细胞中,获得iPS细胞[1].由于iPS细胞绕开了胚胎干细胞(ES)研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍而受到科学家们的青睐,引发了研究热潮.2007年Science、Na-ture和Times等杂志均以iPS细胞逆转"生命时钟"为名将其评选为年度十大科学突破.
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重编程诱导多功能干细胞的研究进展
诱导多功能干细胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs），即通过不同的转导方法，将影响重编程的关键转录因子、RNA、蛋白或小分子化合物导入到成体细胞，使其“返老还童”回到胚胎干细胞状态，并能够被诱导分化产生不同的细胞类型。 iPSCs 的问世，对干细胞的发展具有划时代的意义，使得患者来源的体细胞可以被诱导成iPSCs，用于相关疾病的检测分析与干细胞治疗，规避了免疫排斥和道德论理等问题。但是由于iPSCs诱导的低效性和致瘤性，使得这个“新星”在临床中的应用被质疑，目前科学家一直围绕这2个核心问题展开研究，通过改进转导途径，改变重编程方法来提高它的安全性和效率，并取得了一系列喜人的结果，从而使iPSCs未来用于临床的前景变得越来越光明。
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Ⅰ型纳离子通道基因α亚基c.5768A＞G突变型多能性干细胞多向分化能力的研究
目的 研究携带有人Ⅰ型纳离子通道基因α亚基(SCN1A)基因c.5768A＞G杂合突变的诱导多能性干细胞(iPSCs)在裸鼠体内的多向分化能力. 方法 将人源SCN1A c.5768A＞G杂合突变iPSCs细胞株分别注射到3只NOD/SCID小鼠同侧前肢皮下组织和后肢肌肉组织中,40 d后观察成瘤情况,记录畸胎瘤大小;取出畸胎瘤组织制作石蜡切片,进行HE染色,观察畸胎瘤的细胞形态特征;提取畸胎瘤组织基因组DNA,PCR扩增带有c.5768A＞G突变位点的片段并对其进行测序及生物信息学分析. 结果 注射iPSCs 40 d后,1只NOD/SCID小鼠前肢皮下和后肢肌肉中均有畸胎瘤形成;HE染色显示畸胎瘤组织中至少有3种类型的细胞,分别为源于内胚层的腺体细胞、源于中胚层的脂肪细胞和源于外胚层的成纤维细胞;测序分析显示畸胎瘤组织基因组中存在SCN1A基因c.5768A＞G杂合突变;生物信息学分析显示该位点为高危险性突变. 结论 人源SCN1A基因c.5768A＞G杂合突变型iPSCs具有分化成三胚层的多向分化能力.
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体内诱导多能干细胞与机体的损伤修复及再生
细胞单向分化的假说在近年来受到挑战,越来越多的证据表明,高度分化的细胞可以在一定条件下转化为干细胞.而近来发现了两例小鼠体内由机体损伤干细胞缺失引起的高度分化细胞去分化形成干细胞的证据.这表明,哺乳动物可以不依赖外源干细胞的导入,而是由自体细胞的去分化成为多能性干细胞、增殖与再分化而起到修复损伤的作用.对于自体去分化再生机制的探究可能会引起一些具有挑战性的观念,这对于损伤修复,治疗肿瘤和众多难愈疾病有着重要的理论意义和极大的应用前景.
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血细胞诱导iPSC的研究进展及在输血医学上的应用
自2007年日本[1]和美国[2]科学家分别宣布用4个转录因子将人成纤维细胞诱导成具有和胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)类似功能的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)后,关于它的研究迅猛发展,研究成果层出不穷.用于重新编程的转录因子从4个(Oct 4/Sox 2/Klf 4/c-Myc或Oct 4/Sox 2/Nanog/Lin 28)逐渐减少为2个(Oct4/Sox2)[3]甚至1个(Oct4)[4].将转录因子导入受体细胞的载体也由整合型的病毒载体逐渐向安全性高的非整合型载体发展.用于诱导人iPSC的细胞来源也越来越广泛,如神经干/祖细胞[4]、精原干细胞[5]、头发角质细胞[6]和血细胞[7,8 ]等.在众多细胞来源中,血细胞因资源丰富且采集方便、所需前培养时间短、iPSC诱导效率高而越来越受关注.我们就血细胞向iPSC诱导的研究进展及iPSC在输血医学上的应用前景做一综述.
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细胞治疗领域新进展
细胞治疗按照细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗,干细胞治疗涉及治疗的疾病比较广泛,又可以细分为成体干细胞[造血干细胞( HSC )&间充质干细胞( MSCs) ]、胚胎干细胞( ESC)和诱导多能干细胞( iPSC). 免疫细胞治疗主要针对肿瘤及免疫相关性疾病,按照抗原特异性又可以细分为抗原特异性免疫细胞治疗和非抗原特异性免疫细胞治疗.
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SOX基因异常表达与胃肠癌发生发展关系的研究进展
SOX基因家族是一类编码转录因子的基因,该家族成员在性别决定及胚胎发育过程中起着重要作用,SOC蛋白的典型特征就是具有一个保守的HMG基序.研究发现,SOX基因异常表达与胃肠癌的发生发展有一定的关系,如SOX2基因的表达下调和SOX18基因的过表达与胃癌的发生有关;SOX4基因的高表达、SOX7和SOX17基因的表达下调均可以激活wnt信号通路,与结肠癌的发生发展有一定关系;此外,SOX7基因的表达下调还与直肠癌的发生发展有关.本文就SOX基因异常表达与胃肠癌发生发展的关系作一综述.
