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雷公藤多甙诱导类风湿关节炎患者外周血单个核细胞的凋亡
目的:研究雷公藤多甙诱导类风湿关节炎患者外周血单个核细胞的凋亡的影响,进一步揭示雷公藤多甙治疗类风湿关节炎的作用机制.方法:选取2014年7月至2015年7月在我院诊治的31例类风湿关节炎患者为研究对象,体外培养类风湿关节炎患者外周血单个核细胞,并加入不同浓度的雷公藤多甙,然后观察单个核细胞的凋亡.结果:雷公藤多甙抑制蛋白或DNA合成为主,PBMC呈现出明显的凋亡形态.结论:雷公藤多甙可诱导滑膜细胞凋亡,这可能是其治疗类风湿关节炎的作用机制之一.
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重组乙型肝炎表面抗原(汉逊酵母菌表达)免疫小鼠后不同细胞免疫测定方法的比较研究
目的 探讨不同细胞免疫测定方法 对小鼠免疫乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 后细胞免疫应答测定的影响.方法 小鼠皮下接种 HBsAg,于免疫后 4、7、10、14 和 25 d 分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT) 测定 MNC 细胞体外刺激后所产生的细胞因子 IFN-γ斑点形成细胞计数(SFC),其中刺激物选择多肽和 HBsAg;流式荧光检测技术(Luminex)测定 MNC 体外经 HBsAg 刺激后所产生的细胞因子 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-10 含量;小鼠血清检测抗-HBs.结果 小鼠接种 HBsAg 后,应用 ELISPOT 法测定, 7 d 和 14 d 小鼠 IFN-γ阳转率分别为 60% 和 80%;而应用 Luminex 方法 测定,7 d 和 14 d 小鼠 IFN-γ阳转率均为 80%;IL-4、IL-5、IL-10 阳转率分别为 60%,80%;100%,100%;80%,100%;25d 时,IFN-γ与 14 d 比较统计学上差异有统计学意义( P25,14 d=0.030,＜0.05),而 IL-5、IL-10 和 IL-4 与 14 d 比较差异均无统计学意义 ( P＞0.05 ).抗-HBs 水平随时间而呈上升趋势.结论 Elispot 和 Luminex 法测定小鼠 IFN-γ应答符合率高,小鼠接种单针 HBsAg 后细胞免疫应答高峰为免疫后 7～14 d.25 d 时 IFN-γ分泌水平随抗-HBs 抗体水平升高而下降,而 IL-4、IL-5、IL-10 分泌继续保持较高水平.
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补肾强督方对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞产生MMP-9和TIMP-1的影响
目的:为探讨基质金属蛋白酶在强直性脊柱炎炎性骨破坏中的作用和补肾强督方治疗强直性脊柱炎的作用机制,比较强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞(PBMC)产生基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)与健康对照者之间的差别.并研究补肾强督方治疗前后两者的变化.方法:2005年3月至2006年3月活动期强直性脊柱炎患者30例,其中男27例,女3例;年龄16～15岁,平均(30.8±8.8)岁;病程0.5～10年.经补肾强督方治疗3个月后,做自身前后对照,并设立健康对照组20例,常规分离血清和PBMC,将PBMC用PHA/PMA刺激后收集上清,应用RT-PCR检测PBMC的MMP-9和TIMP-1的mRNA表达水平,应用EUSA检测血清和细胞上清中MMP-9和,TIMP-1的含量.结果:与健康对照组相比,患者治疗前血清中MMP-9和TIMP-1浓度明显升高,患者治疗后与治疗前相比MMP-9和TMMP-1浓度显著降低.经PHA/PMA刺激后,患者治疗前的PBMC表达MMP-9和TIMP-1 mRNA水平明显上调,细胞上清液中MMP-9和TIMP-1量明显升高,与健康对照组相比差异有统计学意义.患者治疗后PBMC表达MMP-9和TIMP-1 mRNA水平明显下调,细胞上清液中MMP-9和,TIMP-1含量均显著下降,与治疗前相比差异有统计学意义.结论:强直性脊柱炎活动期患者的PBMC表达和释放MMP-9和TIMP-1增强.补肾强督方可以显著降低强直性脊柱炎活动期患者MMP-9和TIMP-1的产生.
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中医不同证型帕金森病患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究
目的 研究中医肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)的比较蛋白质组差异,从蛋白表达水平上探讨中医肝阳化风证和血虚生风证的本质.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人PBMC总蛋白质,考马斯亮蓝染色,PDQuest 2-DE软件分析,对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱,用Mascot查询系统查询SWISS-PROT数据库.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳考染图谱,对其中的15个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析,经数据库查询,初步鉴定为一些与细胞骨架,抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、细胞周期调控等有关的蛋白质.结论 建立了帕金森病肝阳化风证和血虚生风证PBMC的双向凝胶电泳图谱,提示帕金森病肝阳化风证和血虚生风证患者和正常人的PBMC的蛋白质表达具有差异,这种蛋白质组的差异分析有助于为研究肝阳化风证和血虚生风证本质在蛋白质水平上提供物质基础.
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当归多糖协同Epo对造血干/祖细胞JAK2/STAT5信号传导通路的影响
目的:探讨当归多糖(APS)对捌控红系血细胞增殖分化有关的细胞内JAK2/STAT5信号传导通路的影响,阐述当归多糖促进血细胞发生的可能机制.方法:分离纯化胎儿脐带血单个核细胞,在常规体外培养体系加入APS(200 mg·L~(-1))作用细胞24 h,促红细胞生成素(Epo)分别刺激0,2,5,30 min,免疫细胞化学与激光共聚焦显微镜观察细胞STAT5的表达;Western-blotting增强化学发光法检测细胞JAK2与浆和核中STAT5的表达.结果:APS协同Epo对STAT5的表达影响显著,对照组与APS组在4个时间点STAT5的表达水平有显著差异,JAK2、细胞浆和核中STAT5表达较对照组显著增加,且在Epo刺激5 min时表达强.结论:APS能协同Epo促进造血细胞增殖分化,其机制与影响细胞内的JAK2/STAT5信号传导通路有关.
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明胶-Ficoll法分离骨髓单个核细胞的方法学探讨
目的 比较直接利用Ficoll一步法和明胶- Ficoll两步法分离骨髓单个核细胞(MNCs)的效果.方法 无菌条件下取入骨髓液40mL,平均分为两份.一份采用Ficoll一步法直接分离MNCs；另一份先采用明胶沉淀红细胞后,再利用Ficoll分离MNCs.比较两者的分离效率、细胞活力、CD34+和CD44 +/CD71+的表达规律.结果 一步法和两步法分离效率、细胞活力差异无统计学意义；两步法分离所得的MNCs表达CD34+的细胞数和CD44+/CD71+的细胞数高于一步法,差异有统计学意义.结论 采用明胶- Ficoll两步法分离骨髓单个核细胞不但不会增加MNCs的损失,还可更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞.
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CML患者骨髓单个核细胞基因表达谱分析
目的探讨慢性髓细胞性白血病(CML)的基因表达变化.方法分别从正常人和CML患者骨髓样品中抽取骨髓单个核细胞,分离出cDNA片段,然后再逆转录成cRNA并标记后,与人的全基因组表达谱芯片杂交,ABI 1700芯片分析系统进行分析基因表达谱的差异.结果总共发现差异表达的基因有6706个,其中与CML相关的差异基因有75个(上调19个,下调56个).结论全基因组寡核苷酸基因芯片在分析基因表达谱差异研究中具有广泛的应用价值.
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人外周血及脐血树突状细胞的体外分离培养
取正常人外周血或脐血,经淋巴细胞分离液分离,取中间白膜层,培养板中进行粘附,粘附细胞加培养液和细胞因子(外周血加GM-CSF和IL-4,脐血加GM-CSF和TNF-α)培养,对其形态、表型和功能分别进行鉴定和测定.结果表明约经过1周左右培养,悬浮细胞表现为典型的DC形态,带有毛刺样凸起,经DC单克隆抗体染色后用流式细胞仪测定脐血72%为DC,外周血93%为DC,并且可以刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.所以通过这样的不同细胞因子组合可以从人外周血和脐血中诱导培养出大量的DC细胞,为其进一步的研究奠定了基础.
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大鼠骨髓来源的平滑肌祖细胞培养及鉴定
目的 培养和鉴定从鼠骨髓中分离的平滑肌祖细胞,观察其在体外增殖、分化过程中相关细胞表型的变化.方法 用密度梯度离心法获得鼠骨髓单个核细胞,用条件培养基进行诱导分化,免疫荧光双标技术(α-SMA、CD14)鉴定平滑肌祖细胞(SPC).Western blot检测α-SMA蛋白,Real-time PCR法检测α-SMA mRNA表达.结果 鼠骨髓单个核细胞诱导培养4 d时开始贴壁,7 d变为梭形,14 d呈典型的"峰""谷"样形态;4 d时开始出现α-SMA-CD14双荧光阳性细胞;培养1 d时无α-SMA蛋白表达,4 d后增强,10～14 d达高峰,21 d仍持续高水平;培养1 d的细胞α-SMA mRNA表达低(P<0.01),4 d后增强,14 d达高峰(P<0.01),21 d后仍持续高水平.结论 本试验成功地从鼠骨髓单个核细胞中分离培养出SPC,并在体外扩增分化成平滑肌样细胞.
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人脐血细胞在肝损伤裸鼠体内向肝细胞的分化
目的探讨在制备的肝损伤模型中人脐血单个核细胞向肝细胞的分化能力. 方法采用腹腔注射CCl4和5-氟尿嘧啶的方法制备肝损伤模型,将分离的脐血单个核细胞以2×107/ml经尾静脉注射入裸鼠体内.4周后处死裸鼠取肝组织.以RT-PCR方法对ALB、AFP mRNA的表达进行检测;并用免疫组织化学SP染色检测人HSA、PCNA、ALB的表达情况.结果RT-PCR显示ALB、AFP mRNA在人肝组织移植组中表达呈阳性,而在损伤未移植组和正常对照组表达为阴性;免疫组织化学染色表明,在裸鼠肝实质区域出现人HSA、PCNA和ALB阳性表达细胞.结论人脐血单个核细胞在裸鼠体内确有向肝细胞分化的趋势.
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人活体小肠移植术后病理改变
小肠移植术后病理检验是关键.小肠移植术后常见的病理改变包括:①急性排斥反应,以单个核细胞为主的混合性炎细胞浸润、肠隐窝细胞损伤、隐窝凋亡小体出现以及黏膜完整程度为诊断标准,共分为不确定的急性排斥反应,轻度急性排斥反应,中度急性排斥反应和重度急性排斥反应4级;②慢性排斥反应;③移植物抗宿主病;④肠道细菌感染;⑤肠道病毒感染.
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肝硬化患者外周血CXCR1、CXCR2表达及其与血清ALT、AST水平的相关性
目的 探讨肝硬化患者外周血CXCR1、CXCR2表达及其与血清ALT、AST水平相关性. 方法 以实时荧光定量PCR检测65例肝硬化患者外周血CXCR1、CXCR2 mRNA水平,设GAPDH为参照,以logcDNA/logGAPDH比值代表终的mRNA水平.以实时荧光PCR检测患者外周血HBV载量. 结果 肝硬化患者PBMCs内CXCR1mRNA表达量为(0.6925±0.1354) logcDNA/logGAPDH,正常组为(0.3743±0.0382) logcDNA/logGAPDH,差异有统计学意义(P＜0.01);CXCR2 mRNA表达量为(0.4344±0.0694) logcDNA/logGAPDH,与正常组(0.4534±0.0423)logcDNA/logGAPDH比较,差异无统计学意义(P＞0.05).肝硬化患者PBMCs内CXCR1 mRNA与血清ALT、AST均显著相关((rALT=0.687,rAST=0.601,P＜0.01)；CXCR2 mRNA与ALT、AST无相关性((rALT=0.143,rAST=0.196,P＞0.05).HBV DNA(+)组与HBV DNA(-)组相比,PBMCs内CXCR1 mRNA水平增加(P＜0.01),CXCR2 mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 肝硬化患者PBMCs内CXCR1表达升高,与血清ALT、AST水平呈正相关,并参与肝硬化的致炎分子病理过程,而CXCR2在介导肝硬化致炎病理过程中的作用较弱.HBV似可促进以CXCR1介导为主的炎症反应.
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细粒棘球蚴囊液对外周血淋巴细胞的影响
目的研究细粒棘球蚴囊液对健康人外周血单个核细胞(PBMC)及Jurkat T淋巴细胞等的影响. 方法 PBMC及Jurkat T淋巴细胞用含不同浓度(1 000、100和10 μg/ml)囊液的DMEM培养基培养5 d后,台盼蓝染色检测细胞活力.用含植物血凝素(PHA)的DMEM培养基培养PBMC,以 MTT法观察PBMC增殖情况,用流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞数量及CD4+/CD8+值,用原位末端标记法和Hoechst33258荧光染色法检测PBMC细胞凋亡. 结果各浓度囊液对PBMC和Jurkat T淋巴细胞未显示出毒性作用.囊液不影响PHA 对PBMC的增殖功能.在1 000 μg/ml囊液组CD4+、CD8+细胞数量与空白对照组(CD4+: 72.08±4.10,CD8+:29.32±2.62)相比,CD4+(49.32±8.32)显著减少(P<0.05),CD8+数量(32.02±6.57)略增加(P>0.05),CD4+/CD8+比值减少.未见细胞凋亡现象.结论细粒棘球蚴囊液对外周血单个核细胞的生长无抑制作用,但可以使CD4+、CD8+细胞的数量和比例改变,向Th2免疫抑制方向转变.
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实时荧光定量RT-PCR检测血清和单个核细胞中HCV RNA的意义
目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测血清和外周血单个核细胞(PBMCs)中HCV RNA含量及其临床价值.方法 采集可疑丙型病毒性肝炎病人血,用FQ-RT-PCR分别检测血清和PBMCs中HCV RNA含量.血清或PBMCS HCV RNA阳性者都视为HCV RNA阳性.结果 检测可疑患者180例,HCV RNA阳性106例.其中血清HCV RNA阳性84例,占79.25%;PBMCs HCV RNA阳性63例,占59.43%.HCV RNA阳性比率血清高于PBMCs (χ2=9.78,P＜0.01).单独血清HCV RNA阳性43例,占40.57%;单独PBMCs HCV RNA阳性22例,占20.75%;血清和PBMCs 中HCV RNA同时阳性41例,占38.68%.血清和PBMCs HCV RNA含量差异无显著性.结论 同时检测血清和PBMCs HCV RNA可提高HCV感染诊断的阳性率,检测PBMCs HCV RNA对抗病毒治疗的疗效评价及治疗时间有重要意义.
关键词： 丙型肝炎病毒 单个核细胞 荧光定量聚合酶链反应 -
冠心病患者外周血单个核细胞HCMV-DNA的荧光定量PCR检测
目的 了解冠心病(CHD)患者外周血单个核细胞(PBMCs)人巨细胞病毒(HCMV)-DNA存在情况并探讨其临床意义.方法 应用实时荧光定量PCR(real time FQ-PCR)方法,对62例CHD患者,29例其他心血管疾病患者和30例健康体检者的PBMCs内HCMV-DNA进行定量检测.结果 CHD患者PBMCs的HCMV-DNA检出率41.9％,其他心血管疾病组10.3％,正常对照组10.0％,差异有统计学意义(P＜0.05).CHD组HCMV-DNA载量介于103～105拷贝/ml者为12例,占阳性例数的46.1％(12/26),介于105～106拷贝/ml者为8例,占阳性例数的30.7％(8/26).结论 CHD患者PBMCs的HCMV感染可能在其致动脉粥样硬化性发病过程中发挥重要作用.
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外周血单个核细胞DNA提取方法的研究进展
DNA的提取是分子生物学研究的基础技术,提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件.外周血作为一种常用的临床检测材料,如何从外周血单个核细胞中快速、高效的分离提取基因组DNA,对于临床血液检验与分析非常重要.目前,DNA的抽提方法有很多,如酚-氯仿法、盐析法、离心吸附柱法等人工方法,以及磁珠法等半自动方法及试剂盒法.本文就从外周血血液中提取DNA方法的原理、具体操作步骤及方法评估等给予简要的综述.
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不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响
为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化,将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天,在0天,7天检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位(CFU)数.根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组;SF组(SCF+FL);SFT组(SCF+FL+TPO)和SFT6组(SCF+FL+TPO+IL6).结果表明,和对照组相比,SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增,加入TPO后即SCF/FL/TPO组合能有效的扩增脐血细胞,但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生(P＞0.05);SF,SFT和SFT6 3组的细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞CD49d,CXCR4的表达,但3组之间差异无显著性(P＞O.05).结论:SF组合可协同扩增人造血细胞,但协同作用较弱;TPO在脐血造血干/祖细胞体外扩增中起重要调节作用,而IL-6作用不显著;SCF/FL/TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增,而且可上调脐血造血细胞CD49d,CXCR4表达.
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体外扩增的脐血单个核细胞植入NOD/SCID小鼠的研究
为了探讨在无血清、无基质培养条件下SCF、FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞(MNC)的佳移植时机及植入潜能,将SCF,FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞培养14天,在0、7、10和14天检测有核细胞数(TNC),CD34+细胞数,CD34+CXCR4+细胞数,CD34+CD49d+的细胞数及集落形成单位(CFU)数,并将SCF+FL+TPO 3种因子组合的无血清无基质条件下扩增培养7天前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠,6周后用流式细胞术,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果表明,经过14天的培养,脐血细胞得到了有效的扩增,TNC数,CD34+细胞数,CD34+CD49d+的细胞数于7天达高峰,其后开始下降,而CFU数,CD34+CXCR4+细胞数于第10天达高峰.在移植6周后,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠的存活率和人源性CD45+细胞的检出率分别为56.25%和(1.39±0.63)%,高于新鲜脐血移植组31.25%和(0.73±0.16)%,亦高于生理盐水移植组(0和0),差异有显著性(p＜0.05),扩增脐血移植组有6只NOD/SCID小鼠骨髓细胞中可检测到人特异ALU序列的表达.结论:体外培养7-10天可能是收获细胞的佳时机;SCF+FL+TPO 3种因子组合扩增7天的脐血单个核细胞能够植入NOD/SCID小鼠,其植入水平优于未扩增的脐血;上调脐血造血细胞上CXCR4,CD49d的表达可能会增加脐血造血细胞的植入能力.
关键词： 脐血 单个核细胞 体外扩增 NOD/SCID小鼠 -
慢性淋巴细胞白血病患者单个核细胞端粒长度与端粒酶表达活性研究
本研究检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者端粒、端粒酶表达,探讨二者与CLL预后的关系.用TelFISH半定量法分析外周血和/或骨髓单个核细胞的端粒长度;用TRAP-ELISA法定量检测外周血和/或骨髓单个核细胞端粒酶表达活性;用流式细胞术检测ZAP70及CD38的表达.结果表明:不同分期患者端粒长度进行比较时,端粒长度有随分期增高而增长的趋势,两两间比较时Rai Ⅲ-Ⅳ期与Rai 0期、Ⅰ-Ⅱ期之间,Binet C期与A期、B期之间差异具有统计学意义;Rai 0期与Ⅰ-Ⅱ期之间、Binet A期与B期之间差异不具有统计学意义.ZAP 70阴性组和阳性组端粒长度近似,CD38阳性组较阴性组端粒长度有缩短的趋势,但其差异不具有统计学意义.不同分期患者进行比较时端粒酶表达活性,有随分期增高而升高的趋势;Rai分期各期间进行比较时,端粒酶表达活性有随分期增高而升高的趋势.有1例CLL患者缓解期无端粒酶表达,复发期端粒酶表达升高,提示端粒酶表达可能与疾病活跃程度相关.结论:端粒长度与Rai和Binet分期相关,晚期患者较早、中期患者端粒长度短;端粒酶表达有随分期增高而升高的趋势.初诊和治疗后CLL患者端粒酶表达无差异,表达稳定,未见治疗对它的影响.
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利用单个核细胞培养扩增NK细胞体系探索
目的:探寻一种通过单个核细胞使自然杀伤(NK)细胞在体外培养扩增的新方法,为NK细胞免疫治疗奠定实验基础.方法:收集3份健康足月孕妇的脐带血,应用密度梯度法分离单个核细胞(PBMNC),每份单个核细胞样本均分为CD16 mAb、CD3 mAb和CD16 mAb+CD3 mAb处理3组.使用含自体血浆、重组人IL-2、IL-15和IL-21的无血清培养液,在相同条件下培养扩增14 d,计算其扩增倍数.应用流式细胞术测定CD56+ CD3-比例;以K562细胞为靶细胞,应用MTT法测定所培养的NK细胞在不同效靶比条件下的杀伤率.结果:培养14 d后,CD16mAb、CD3 mAb和CD16 mAb+CD3 mAb组细胞总数分别扩增45.71±5.54、87.41±19.77和51.84±4.88倍,在CD3 mAb组显著高于其它2组(P＜0.05).培养前CD56+ CD3-细胞比例为0.1663±0.0201,经培养扩增14 d后CD16 mAb、CD3 mAb和CD16 mAb +CD3 mAb组CD56+ CD3-细胞比例分别为0.8167±0.0500、0.8077±0.0589和0.8077±0.0273,3组之间无显著性差别.培养14 d后,MTT法检测显示,在效靶比为1∶1、5∶1和10∶1时3组杀伤效率均无显著差异(P＞0.05).结论:使用抗CD3 mAb及IL-2,IL-15和IL-21培养单个核细胞,可获得高纯度和高杀伤活性的NK细胞.本研究为NK细胞的治疗提供了一个简单有效的方法.
