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低氧微环境下胶质瘤干细胞表型的改变与RNA结合蛋白相关
目的 研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系.方法1% O2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20% O2为常氧对照.分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测干性相关蛋白和RNA结合蛋白表达水平的变化;通过吸光度扫描进行统计分析.结果 低氧条件下肿瘤干细胞的增殖能力下降(P<0.05),自我更新能力上升(P<0.05),HIF-1α和干性标志物Nestin和SOX2上调(P<0.01;P<0.05).与常氧组相比,低氧组胶质瘤干细胞的多种RNA结合蛋白表达水平发生变化:hnRNPF、UNRIP以及HuD表达水平上调(P<0.05),PCBP2和UNR表达水平下调(P<0.01;P<0.05),而其他RNA结合蛋白(hnRNPK、ADAR1、PCBP1、CIRP、EBP1、eEF1A、PTBP1、PTBP2)表达水平没有显著性变化.结论 低氧微环境下,胶质瘤干细胞的表型变化与RNA结合蛋白hnRNPF、UNRIP、HuD、PCBP2和UNR表达水平相关.
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Notch信号通路对胶质瘤干细胞的调控作用研究进展
胶质瘤干细胞(GSCs)是胶质瘤放化疗耐受和复发的重要原因.而Notch信号通路对GSCs形成、维持及胶质瘤患者放化疗耐受中起关键的调控作用.因此,深入研究GSCs中Notch信号通路调控机制对开发以该通路为靶向的治疗药物具有积极意义.
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胶质瘤干细胞研究进展
随着对肿瘤干细胞(tumor stem cells)理论的深入认识和分离、培养肿瘤干细胞实验技术的不断进步,胶质瘤内肿瘤干细胞的存在已经有较多的证据和研究.这方面的研究不仅有助于深化人们对胶质瘤发生、复发和侵袭机制的认识,更重要的是可能改变以往胶质瘤的治疗策略,影响十分深远.新近,有学者将来自胶质瘤的肿瘤干细胞或具有干细胞特性的胶质瘤细胞称为"胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSC)"[1],较好地反映了这类细胞的特性.
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胶质瘤干细胞研究的新进展及展望
胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤,多数呈浸润性生长,手术不易全切,对放化疗不敏感,故复发率高,预后普遍较差[1-2].基因干预技术、分子靶向治疗、免疫治疗等新技术有可能成为未来治疗胶质瘤的有效手段[2-4],而阐明胶质瘤发病机制,是确定关键治疗靶点及发现诊断、鉴别诊断和确定预后评估分子标志物必须解决的关键问题.胶质瘤干细胞(glioma stem cells)的发现及研究新进展为揭示胶质瘤发生、发展的分子机制及研发诊疗新技术打开了新视野,已成为当今胶质瘤研究的热点领域[2-3,5].
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人胶质瘤细胞系 SU3与小鼠巨噬细胞共培养产生的融合细胞具有恶性转化的特点
目的：通过胶质瘤细胞（SU3）与巨噬细胞（macrophage，Mφ）共培养来证明胶质瘤间质中的Mφ恶性转化是SU3与Mφ融合导致的。方法将转有红色荧光蛋白基因（ RFP）的SU3与表达增强型绿色荧光蛋白（ EGFP ）的小鼠腹腔冲洗出的Mφ进行体外共培养；用单克隆方法建立表达RFP＋/GFP＋双色荧光（黄色）的细胞系，然后进行癌细胞相关表型分析、致瘤性试验、鼠巨噬细胞标记物检测。结果（1）这两种细胞共培养后，细胞群中出现为数不多的黄色细胞，并成功单克隆到C3、C4和C12三株细胞。（2） C12继续传代培养后分化出RFP＋、EGFP＋和RFP＋/EGFP＋三种类型细胞，但随着传代次数增多，EGFP＋（绿色）细胞比例逐渐升高而成为主体，RFP＋/EGFP＋（黄色）细胞比例逐渐下降并维持在较低水平，而RFP＋（红色）细胞基本消失。（3） C12细胞株中的EGFP＋细胞具有以下特点：生长接触抑制消失、增殖速度快、染色体异倍体等癌细胞特征；在裸小鼠体内具有高致瘤率（5/5）；表达巨噬细胞特异性标记CD68，大部分染色体为鼠端着丝粒。结论本实验用体外模型证明我们先前在实体瘤中观察到的人脑胶质瘤细胞诱导宿主巨噬细胞恶性转化是通过细胞融合途径实现的。本实验与我们先前从荷瘤鼠实体瘤组织中克隆到恶性转化的巨噬细胞株（ ihCTC）的体内实验一起，相互印证了肿瘤微环境中宿主巨噬细胞恶性转化是客观存在的。宿主细胞与肿瘤细胞融合后发生的恶变既为肿瘤恶性进展和肿瘤异质性增添了新的内涵；又为肿瘤靶向治疗增加了新的靶标。
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胶质瘤干祖细胞体外诱导恶性转化的树突状细胞株 SU3-ihDCTC 的建立及其特征分析
目的 探讨胶质瘤干祖细胞体外诱导恶性转化的树突状细胞株的建立及其特征分析.方法 取表达绿色荧光蛋白( EGFP)的小鼠骨髓腔冲洗细胞,用树突状细胞诱导培养方法,与表达红色荧光蛋白( RFP)的人胶质瘤干祖细胞SU3共培养,从单克隆增殖能力强的EGFP(+)永生化细胞中随机选取1株检测相关分子标志物,行染色体分析和致瘤试验. 结果 被鉴定分析的1株永生化EGFP(+)细胞形态为树突状,DC标志蛋白CD11c、CD80、信号调节蛋白α( SIRP-α)均高表达,此外表达宿主鼠源性β-肌动蛋白和EGFP;且兼具高增殖、侵袭和移植致癌的潜能;染色体核型为异倍体. 结论 在体外共培养系统中,成功地建立了1株被胶质瘤干祖细胞SU3诱导恶性转化的永生化树突状细胞株,有望作为工具细胞进一步用于非可控性炎症细胞的相关研究.
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脑恶性胶质瘤术后放化疗肿瘤复发再手术治疗的临床研究
目的 探讨脑恶性胶质瘤术后放化疗复发肿瘤再手术治疗的临床意义.方法 选取有完整 临床资料的原发恶性胶质瘤术后及其复发再手术治疗患者48 例,术后同步放和(或)化疗.采用免疫荧光双 染色法检测并比较脑胶质瘤干细胞(GSCs)标记物CD133/Nestin 在原、复发胶质瘤中的表达,Kaplan-Meier 生 存分析和Cox 回归风险模型分析原发术后放化疗肿瘤复发患者再次手术术前KPS 评分、肿瘤体积、切除程 度、GSCs 数目、两次手术间隔等因素与预后的关系.结果 CD133/Nestin 在原、复发恶性胶质瘤组织中阳性 表达百分数分别为(3.06 ±0.38)%、(14.89 ±2.54)%,差异有统计学意义(P <0.001);单Kaplan-Meier 生存 分析示原发术后放和(或)疗肿瘤复发再手术术前KPS 评分≥70 分、肿瘤全切、肿瘤体积<50 cm3 等因素显 著延长患者二次术后生存时间(P <0.05);Cox 回归风险模型分析表明再手术术前KPS 评分、肿瘤体积、切除 程度等因素可作为独立的预后因素(P <0.05).结论 脑恶性胶质瘤术后放和(或)化疗复发肿瘤富集胶质 瘤干细胞,复发胶质瘤再手术治疗是靶向胶质瘤干细胞治疗的重要举措,早期积极再次手术有益于延长患者 生存时间和提高生存质量.
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microRNA-181b 影响 U87胶质瘤细胞干细胞对替莫唑胺化疗耐受性的实验研究
目的本研究旨在建立miR-181 b慢病毒载体感染U87胶质瘤干细胞模型后，检测其对TMZ化疗耐受性的变化，并探讨miR-181 b对于恶性脑胶质瘤（ GBM ）辅助化学治疗的意义。方法通过miR-181 b慢病毒表达载体转染U87胶质瘤干细胞，提高miR-181 b在U87胶质瘤干细胞中的表达。进一步通过RT-PCR、二次神经球形成实验、琼脂糖集落形成实验、MTT实验来分析miR-181 b对于 U87胶质瘤干细胞在TMZ化疗耐受性方面的作用。结果 miR-181 b慢病毒表达载体转染U87胶质瘤干细胞后，U87胶质瘤干细胞中的miR-181b明显上调，而且U87胶质瘤干细胞的生长受到明显抑制；miR-181b可以加强TMZ抑制U87胶质瘤干细胞的生长的作用。结论 miR-181b可以加强TMZ抑制U87胶质瘤干细胞的生长，miR-181b可能对于提高U87胶质瘤干细胞对TMZ的敏感性，降低化疗耐受性起到一定作用。
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胶质母细胞瘤室管膜下区(SVZ)放疗研究进展
胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)中包含有少量的胶质瘤干细胞,这些干细胞有独特的自我更新和分化的能力.在成年人脑组织中室管膜下区包含大量神经干细胞,这里可能是胶质瘤干细胞的储藏库,可以促进肿瘤形成及复发.SVZ受累的胶质母细胞瘤术后容易早期复发及颅内转移,因而SVZ的放疗对胶质母细胞患者的生存可能有潜在的影响.本综述复习相关的基础研究及临床观察,探讨胶质母细胞瘤患者SVZ放疗的价值以及今后的研究方向.
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脑胶质瘤干细胞研究进展
脑胶质瘤是常见的脑原发恶性肿瘤,其治疗主要依据WHO分级;手术切除为首选,术后放疗及放化疗是提高脑胶质瘤生存期的重要手段.低分级脑胶质瘤的治疗效果较好,生存期较长;而高分级患者治疗后的生存期只能以月来描述.脑胶质瘤治疗失败的主要原因是局部复发,而导致复发的重要原因是胶质瘤干细胞未得到有效控制.因此,脑胶质瘤干细胞的鉴别及生物学特性的研究成为近年来国内外学者关注的热点,笔者综述脑胶质瘤干细胞的研究进展.
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胶质瘤干细胞的放射抵抗性及机制
胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤,占全部颅内肿瘤的40％～50％,具有显著的侵袭性、化疗抗性和放射抵抗性,目前的治疗方法包括手术切除、化疗、放疗单独或者联合治疗,但患者生存率仍然很低.近发现一类干细胞特性的胶质瘤细胞[CD133+胶质瘤细胞或者多形性胶质母细胞瘤起始干细胞(GBM initiating stem cells,GISC)]具有很强的自我更新、增殖、分化能力,并且是放疗后残存的主要细胞亚群,因此深入研究其放射抵抗性,对于揭示胶质瘤放射抵抗性的机制,提高患者生存率有重要意义,本文就近年来干细胞及其放射抵抗性相关的研究做一综述.
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胶质瘤干细胞抗凋亡和多重耐药基因的表达
目的 从人脑胶质瘤组织中分离、培养胶质瘤干细胞,并探讨其生物学特性及其抗凋亡和多重耐药基因的表达差异.方法 人脑胶质瘤组织经过原代细胞培养后,用无血清培养方法获得胶质瘤干细胞球,用10%的胎牛血清培养诱导分化,分化前后分别做nestin、tubulin-β、GFAP免疫细胞化学荧光染色,并观察胶质瘤干细胞形态学改变.同时,应用实时荧光定量PCR技术检测livin,livinot,livinβ,survivin,MRPI和MRP3 mRNA的表达.结果 有2例分离培养出干细胞球体,这些球体具有典型的干细胞特性,nestin染色为阳性;在无血清培养基中呈悬浮球样生长,能够自我更新和增殖,在有血清培养基中能够分化,tubulin-β、GFAP染色为阳性.胶质瘤干细胞球livin、livinα、livinβ、survivin和MRP-1 mRNA表达量比较胶质瘤组织表达量都有不同程度的升高,而MRP-3mRNA表达量降低.结论 胶质瘤干细胞抗凋亡和MRP-1基因表达量较胶质瘤表达量有不同程度的升高,提示胶质瘤干细胞比较其同源的胶质瘤细胞具有更强的耐药性,这可能是肿瘤耐药的机制.
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胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的研究
目的 探讨胶质瘤干细胞(GSC)对替莫唑胺(TMZ)的敏感性及耐药机制.方法 新鲜多形性胶质母细胞瘤(GBM)标本培养后获得GSC.免疫荧光技术榆测未分化GSC的CD133及分化生长GSC的GFAP的表达,MTS法检测对替莫唑胺的敏感性,流式细胞技术对CD133阳性细胞的比例进行定量,荧光标记的甲基化特异性PCR分析MGMT启动子区域的甲基化状态,Western blot检测抑癌基因PTEN的表达.结果 (1)5例GBM标本中成功获得GSC,符合肿瘤下细胞定义.(2)5个GSC细胞株多数对TMZ不敏感.其中,T509的半数抑制浓度(IC50)为22.3 μmol/L(敏感),T411的IC50为286.3 μmol/L(中度敏感),其余3个细胞株T402,T405及T509的IC50皆大于1000μmol/L(不敏感).(3)CD133阳性细胞比例大于10%的GSC细胞株对TMZ不敏感.(4)MGMT启动子区域呈去甲基化状态的GSC对TMZ不敏感或仅为中度敏感.(5)5个GSC细胞株中,PTEN表达水平差异大,与GSC对TMZ的敏感性无明显关联.结论 GSC对TMZ普遍耐药,与MGMT启动子区域甲基化状态及CD133阳性细胞有关,而与PTEN蛋白表达水平无明显关联.
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缺氧诱导胶质瘤干细胞向血管内皮细胞分化潜能的实验研究
胶质瘤占脑内肿瘤的40％ ～ 45％,具有高侵袭性、高度增殖性,传统手术加放化疗等综合治疗手段主要针对的是肿瘤细胞,疗效不佳[1-3].根据肿瘤的生长、侵袭有赖于肿瘤血管生成的理论产生了抗肿瘤血管生成治疗肿瘤策略,但目前常规的抗肿瘤血管生成治疗效果仍不尽人意[4 ],说明可能存在其他的肿瘤血管生成的机制或其他影响肿瘤血管生成的因素.缺氧可上调人血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGFR)的表达,而VEGF是刺激肿瘤血管生成关键的生长因子,本研究在缺氧条件下培养脑胶质瘤干细胞,探讨其与肿瘤血管生成的关系,为改进抗肿瘤血管生成策略提供新的思路.
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脑胶质母细胞瘤干细胞球中标记滞留细胞表型研究
目的 对悬浮培养的脑胶质母细胞瘤干细胞球中的标记滞留细胞进行表型研究.方法 通过荧光标记滞留分析区分胶质母细胞瘤干细胞球中的标记滞留细胞及标记阴性细胞;通过体外克隆分析比较上述两类细胞的自我更新能力;以Western blot检测分化前后分化标记物的表达,评估其体外分化能力;给予放、化疗处理后检测细胞增殖,评估其放、化疗敏感性;通过免疫缺陷鼠颅内种植,评估其成瘤能力.结果 胶质瘤干细胞球细胞经初始DiI荧光标记示踪2周后,可区分慢增殖的DiI滞留细胞,其比例＜10％及快增殖的DiI阴性细胞.DiI滞留细胞经多次传代克隆分析,其克隆成球率保持恒定,而DiI阴性细胞呈显著下降(P＜0.05).DiI滞留细胞分化后分化标记物GFAP,PDGFRα以及βⅢ-tubulin蛋白表达相对于分化前显著上调(P＜0.05).给予10 Gy剂量照射或500μm/l替莫唑胺处理72 h后,DiI滞留细胞增殖相对于处理前无显著改变,而DiI阴性细胞增殖显著下降(P＜0.05).仅约100个DiI滞留细胞在长追踪观察6个月时在免疫缺陷鼠颅内已可成瘤,而相应数量的DiI阴性细胞未能成瘤.结论 胶质母细胞瘤干细胞球中呈现慢增殖特性的标记滞留细胞相对于标记阴性细富集了肿瘤干细胞.
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硼中子俘获疗法对胶质瘤干细胞增殖和细胞周期的影响
目的 研究硼中子俘获疗法(BNCT)对体外培养人胶质瘤干细胞(GSCs)周期进程的影响及机制,比较GSCs和胶质瘤细胞株SHG-44对BNCT敏感性的差异.方法 首先检测人GSCsSU2和人胶质瘤细胞株SHG-44吸收含硼化合物二羟基苯丙氨酸硼(BPA)的情况,然后采用医院中子照射器(IHNI-1)对含硼(10B)细胞进行照射,克隆存活实验检测细胞的放射敏感性,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期进程,Westem blot检测cyclin B1、CDK1和P21[WAF1]蛋白表达情况.结果 5 mmol/L BPA孵育SU2和SHG-44细胞24h,10B浓度分别可达(1.76±0.28)和(2.50±0.12)μg/107细胞,富含10B的细胞经IHNI-1照射后生存率和增殖率与不含10B的细胞比均明显下降(P＜ 0.05或P＜0.01),SU2细胞经IHNI-1照射4 min时BNCT敏感性低于SHG-44细胞(P＜0.05).与未加BPA而仅用中子照射组比较,经BNCT后G2/M期SU2和SHG-44细胞比例增高(P＜0.05),cyclin B1和CDK1蛋白表达降低(P＜0.01),P21[WAF1蛋白表达增加(P＜0.01).结论 GSCs的BNCT敏感性低于胶质瘤细胞,BNCT可通过抑制细胞周期蛋白形成将细胞阻滞于G2/M期来抑制细胞更新和增殖.
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人脑胶质瘤干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究
目的 探讨体内外原代培养的人脑胶质瘤干细胞(GSCs)与胶质瘤新生血管内皮细胞的关系.方法 新鲜高级别(WHOⅢ级、Ⅳ级)的人脑胶质瘤标本经原代培养获取GSCs,免疫组化法检测其肿瘤干细胞及干细胞标记物Nestin的表达；鉴定后的GSCs经低氧诱导,免疫荧光法检测其诱导分化后内皮细胞标记物CD31、CD144和胶质瘤细胞标记物GFAP的表达,RT-PCR和Western-blot法检测其CD31的表达；建立胶质瘤干细胞皮下荷瘤裸鼠模型,免疫组化技术检测模型中人来源的CD31的表达.结果 (1)悬浮生长的胶质瘤干细胞球样细胞经免疫组化鉴定Nestin表达阳性；(2)低氧诱导后的GSCs能够表达CD31、CD144,有些细胞能够同时表达CD144和GFAP；(3)RT-PCR检测发现GSCs在诱导前后都有CD31 mRNA的表达,而Western-blot检测到只有诱导后的GSCs有CD31蛋白的表达；(4)胶质瘤干细胞荷瘤裸鼠模型的肿瘤组织中部分微血管抗人CD31抗体染色阳性.结论 胶质瘤干细胞不仅在体外低氧条件下可分化为内皮细胞,在体内微环境条件下同样可分化为血管内皮细胞,并参与胶质瘤新生组织的血液供应.
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人脑胶质瘤干细胞的分离培养及初步鉴定的实验研究
一、材料与方法取10例胶质瘤患者术中切除的肿瘤组织,分离成单细胞悬液,接种于添加生长因子(EGF、bFGF、LIF等)的DMEM/F12无血清培养基中,观察各种细胞的生长增殖情况,对照组取3例同期癫痫患者(非脑肿瘤)手术切除病灶,做相同处理,对增殖形成的克隆球连续传代培养,部分克隆球细胞分散后做单克隆培养;
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胶质瘤干细胞错配修复基因hMLH1和hMSH2与替莫唑胺耐药相关性研究
目的 研究替莫唑胺(TMZ)对胶质瘤干细胞(GSC)错配修复基因hMLH1和hMSH2的影响及其与TMZ耐药的相关性.方法 采用悬浮培养法分离培养GSC株.免疫荧光法检测CD133、Nestin和GFAP.细胞毒性实验计算TMZ半数抑制浓度(IC50).甲基化特异性PCR(MSP)和Western blot分别检测hMLH1和hMSH2基因启动区甲基化和蛋白表达.结果 (1)从U251和A172胶质瘤细胞系中成功分离胶质瘤干细胞株U251g和A172g.(2)U251g和A172g的IC50分别为1 695.41 μmol/L和724.63μmol/L.以IC50、150％IC50两种浓度对U251g和A172g诱导培养1周后对应U251g-1、U251g-2和A172g-1、A172g-2,IC50各为1 913 μmol/L、2 555 μmol/L和754 μmol/L、1 549 μmol/L.(3)诱导后的U251g和A172g的hMLH1基因启动区发生异常甲基化和蛋白表达缺失,且A172g的甲基化水平随药物浓度的增加而增高;诱导后的U251g和A172g的hMSH2基因启动区未发生甲基化和蛋白表达缺失.结论 GSC存在于U251和A172细胞系中,对TMZ不同程度耐药.TMZ诱导下,胶质瘤干细胞U251g和A172g错配修复系统功出现异常,主要表现为hMLH1基因启动区甲基化和蛋白表达缺失.
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IL-13Rα2致敏的DC-CTL对人胶质瘤干细胞的体外杀伤效应
目的 比较IL - 13Rα2致敏的DC - CTL对人胶质瘤干细胞和普通胶质瘤细胞的体外杀伤效应.方法 用神经干细胞无血清培养法培养出U251胶质瘤干细胞并进行免疫荧光鉴定,GM- CSF、IL-4体外诱导成树突状细胞(DCs),与人工合成的IL - 13Rα2(345-354)多肽孵育后再激活T淋巴细胞,CFDA - SE/PI双荧光染料标记的流式细胞计数法检测其对U251胶质瘤干细胞和普通U251胶质瘤细胞的体外杀伤作用.结果IL - 13Rα2(345-354)抗原肽致敏的DC - CTL对U251胶质瘤干细胞的杀伤率为(18.59±1.42)％,高于未用抗原肽致敏的DC - CTL及CIK对胶质瘤干细胞的杀伤率,其杀伤率分别为(10.35±0.98)％和(7.15±0.58)％,差异具有统计学意义(P＜0.001).同时,IL- 13Rα2(345-354)抗原肽致敏的DC - CTL对U251胶质瘤干细胞的杀伤率也高于其对普通U251细胞(11.53±0.65)％的杀伤率(P=0.001).结论 IL - 13 Rα2(345-354)致敏的DC - CTL在体外对胶质瘤于细胞具有杀伤作用,且杀伤率高于对普通的胶质瘤细胞.
关键词： IL-13Rα2 胶质瘤干细胞 树突状细胞 CFDA-SE/PI
