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ABCG2在U251细胞株及其干细胞中的表达及意义
目的:研究ATP转运体成员ABCG2在U251细胞和U251干细胞中的表达,并分析其意义.方法:采用含EGF、bFGF、LIF及B27的无血清培养基培养U251细胞,形成U251干细胞球后采用单细胞克隆法继续在无血清培养基中培养.应用细胞免疫荧光染色法对肿瘤干细胞进行鉴定,应用激光共聚焦和Western blot法检测ABCG2在U251细胞及其干细胞中的表达情况.结果:在U251细胞株中成功分离出U251干细胞;免疫荧光染色显示U251干细胞表达CD133;激光共聚焦显示两种细胞ABCG2均阳性表达,主要位于胞膜;Western blot显示ABCG2在两种细胞均有表达,U251干细胞中ABCG2表达明显高于U251细胞,二者差异有统计学意义(P＜0.05).结论:ABCG2在U251细胞株及U251干细胞中均有表达,以U251干细胞中表达量更多.
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内皮细胞通过Hedgehog通路促进胶质瘤干细胞自我更新
目的 探讨Hedgehog通路在内皮细胞促进胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)白我更新中的可能作用.方法 实验以GL261细胞系中分离的GSC和内皮细胞系b.END3为研究材料,采用Transwell双室细胞培养、极限稀释法成球实验、实时定量PCR、Western blot、体内移植瘤实验以及慢病毒载体基凶干扰等方法,检测内皮细胞对GSC成球、成瘤能力、干性基因表达以及Hedgehog信号通路相关的部分基凶表达的影响.结果 与对照组相比:①GSC与内皮细胞共培养后其体外成球能力明显增强,表现为形成干细胞球数目明显增多,体积明显增大,尤其在每孔5个(24.3％ vs 11.3％)和每孔 10个细胞(39.4％ vs 25.8％)的极低浓度下更加明显(P＜0.05).②共培养体系中,GSC的干性相关基凶Oligo2、Bmil与Hedgehog信号通路相关基因Gli1的mRNA和蛋白表达明显增加(P＜0.05).③体内移植瘤实验发现,与内皮细胞共同注射的GSC成瘤能力明显增强,所形成的移植瘤体积显著大于对照组(P＜0.05),而且出现了部分瘤体破溃、小鼠死亡.④通过慢病毒载体基因干扰Smo基因表达抑制Hedgehog信号通路后,内皮细胞促进GSC自我更新的上述现象消失.结论 内皮细胞可能通过激活Hedgehog信号通路促进GSC自我更新.
关键词： 胶质瘤干细胞 内皮细胞 信号转导 Hedgehog通路 -
下调CXCR4表达对胶质瘤干细胞侵袭能力和VEGF分泌量的影响
目的 观察下调胶质瘤干细胞CXCR4表达后对其侵袭能力和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌量的影响.方法 采用间接免疫荧光标记观测U87细胞及其颅内移植瘤标本中胶质瘤干细胞标记物CD133和CXCR4共表达情况;分别从稳定转染CXCR4小干扰RNA质粒的U87细胞和稳定转染阴性对照质粒的U87细胞中培养出胶质瘤干细胞球,并对其进行鉴定,观察两者CXCR4的表达情况;通过Transwell小室比较两者的侵袭能力;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测两者细胞培养上清内VEGF的含量.结果 U87细胞及其移植瘤中均可检测到CXCR4与CD133共表达,下调胶质瘤干细胞CXCR4表达后,胶质瘤干细胞的体外侵袭能力明显下降[干扰组:(17.0±5.8),对照组:(71.5±8.7),P＜0.05],VEGF分泌明显减少[干扰组:24 h(690±24)pg/ml,48 h(1 504±53)pg/ml;对照组:24 h(850±25)pg/ml,48 h(2 001±150)pg/ml,P＜0.05].结论 胶质瘤干细胞表达CXCR4,下调其表达可抑制胶质瘤干细胞的侵袭和促血管生成能力,提示CXCR4可能成为针对胶质瘤干细胞进行治疗的靶点.
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自体荧光技术筛选恶性胶质瘤干细胞的优势分析
目的 探讨利用自体荧光技术筛选胶质瘤干细胞的效果.方法 利用胶质瘤干细胞嗜核黄素的特点,在体外普通胶质瘤干细胞中加入核黄素培养,利用流式细胞仪筛选具有自发荧光的胶质瘤干细胞.CCK-8检测其体外增殖能力.建立小鼠模型,观察小鼠生存能力,观察肿瘤体积、质量.检测肿瘤组织Ki67、PCNA和Nestin的表达水平.结果 通过流式细胞仪筛选出具有自发荧光的胶质瘤干细胞;CCK-8结果显示荧光胶质瘤干细胞的增殖能力更强(P＜0.01);体外荷瘤实验表明,荷有荧光干细胞的小鼠,其生存时间明显降低,肿瘤体积和质量明显增大(P＜0.01).肿瘤石蜡切片免疫组化显示,载有荧光干细胞肿瘤切片中Ki67、PCNA和Nestin含量明显增高(P＜0.05).荧光干细胞的增殖和恶性程度高于目前GL261肿瘤干细胞,同时也能筛选出部分CD133-的具有高恶性程度高和高侵袭性的胶质瘤干细胞.结论 自体荧光技术能较好地筛选出恶性程度高的胶质瘤干细胞.
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阿司匹林对小鼠胶质瘤干细胞增殖及凋亡的体外研究
目的 研究阿司匹林(Aspirin)对小鼠胶质瘤干细胞增殖及凋亡的影响.方法 体外培养小鼠胶质瘤GL261细胞株的干细胞,分为对照组(加入等体积生理盐水)和阿司匹林2.5、5、10 mmol/L处理组(n=5).应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,LDH试剂盒检测细胞受损情况.结果 与对照组相比较:不同浓度的阿司匹林均可抑制胶质瘤干细胞的增殖(P＜0.05),并且呈剂量—时间依赖性.各种浓度的阿司匹林作用后胶质瘤干细胞的成球能力明显下降(P＜0.05).阿司匹林影响胶质瘤干细胞的细胞周期,S期的细胞比例减少,G0/G1期的细胞比例增加(P＜0.05).3种浓度阿司匹林作用3d后,胶质瘤干细胞的凋亡细胞数目增多(P＜0.05),细胞释放LDH明显上升(P＜0.05).结论 阿司匹林具有抑制胶质瘤干细胞的增殖,并促进其凋亡的作用.
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Sox2上调 EGFR 并促进胶质瘤干细胞的自我复制机制的实验研究
目的：观察性别决定区 Y 框蛋白2（Sox2）对表皮生长因子受体（EGFR）的调控及 Sox2对胶质瘤细胞成球率的影响。方法构建表皮生长因子同源受体 ErbB2、ErbB3、ErbB4启动子报告质粒，并用双报告基因检测分析方法检测 Sox2对 ErbB2、ErbB3、ErbB4表达的调控；Sox2表达质粒转染胶质瘤 U251细胞，采用悬浮成球的方法培养 U251细胞并计数成球率，观察 U251细胞的自我复制；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 EGFR 和 ErbB2蛋白的表达情况。结果 Sox2可以增加悬浮培养 U251细胞的成球率（P＜0．05）；上调 ErbB2、ErbB3、ErbB4启动子介导的荧光素酶蛋白表达活性，且表现出剂量依赖性。此外，Sox2可以提高 EGFR 和 ErbB2受体的表达。结论 Sox2可以上调 EGFR 受体并促进胶质瘤干细胞的自我复制。
关键词： 性别决定区Y框蛋白2 胶质瘤干细胞 受体 表皮生长因子 DNA 复制 -
SOX在原发性脑肿瘤中的研究进展
原发性脑肿瘤为神经外科常见的疾病,死亡率占癌症致死人数的7％,了解原发性脑肿瘤的分子途径对确定相关治疗靶点至关重要.SOX基因是一个发育转录调控因子家族,在胚胎发育过程中决定着细胞命运及维持祖细胞的同一性.SOX因子的突变及功能异常与包括多种癌症在内的人类疾病密切相关.通过破译原发性脑肿瘤中由SOX控制的信号通路,有利于深入了解脑肿瘤的发生发展及生物学特点,同时可为靶向治疗原发性脑肿瘤提供新型的候选分子及更有价值的治疗方案.
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胶质瘤细胞及其干细胞的放疗敏感性差异
目的 探讨脑胶质瘤细胞与脑肿瘤干细胞(BTSCs)的放射敏感性差异.方法 胶质瘤细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养.用血清剥夺法(无血清的DMEM/F12培养基添加bFGF、EGF和B27,即干细胞培养液)培养胶质瘤干细胞.CD133免疫细胞化学染色鉴定BTSCs.用直线加速器分别以0、2、4、6、8、10Gy X线照射胶质瘤细胞及BTSCs,然后继续培养36h.流式细胞仪检测上述细胞中CD133+细胞比率.采用MTT法检测细胞的存活情况.结果 胶质瘤细胞中存在BTSCs,后者能在干细胞培养液中存活并悬浮生长,增殖形成克隆球,具有自我更新和增殖能力,表达特异性标志物CD133.胶质瘤细胞及BTSCs在X线照射后,其增殖能力都下降,但BTSCs的下降幅度远没有胶质瘤细胞大(P＜0.05).CD133+比率显示,X射线对普通胶质瘤细胞中极其微量的CD133+细胞几乎没有影响,而BTSCs中的CD133+细胞的比例在0-10GyX射线放射过程中,与放射剂量成正比(P＜0.05).结论 BTSCs的放射敏感性明显低于胶质瘤细胞,其机制可能与放疗过程中CD133+细胞的增加有关.
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胶质母细胞瘤和胶质瘤干细胞
胶质母细胞瘤(GBM)是一种高度恶性、浸润性、异质性和致命性的脑肿瘤,虽然其治疗方法不断改进,但GBM患者的预后依然很差.近年来,肿瘤干细胞学说的提出为肿瘤的产生和治疗提供了新的思路.自脑肿瘤中分离出一群具有自我更新、增殖和神经分化等干细胞特性的肿瘤细胞以来,这群肿瘤干细胞使得GBM的研究也越来越广泛和深入.本文就GBM和胶质瘤干细胞的新相关进展进行综述.
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胶质瘤干细胞与WNT信号通路
胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是人类致死性高的恶性肿瘤之一,目前尚无理想治疗方法.肿瘤干细胞理论表明胶质瘤干细胞(gliomastem cells,GSCs)是GBM生长及复发的根本动力,因而是重要的治疗靶点.GSC受到Notch、WNT、Shh等多个信号通路的调控.近年来研究发现,WNT通路对GSC的干性(stemness)维持起到重要作用.WNT通路中的多个相关分子在GBM及GSC中表达异常,并可通过对WNT活性的调控以调节GSC的干性和致瘤性.同样,WNT还与其它干细胞调控因子及信号通路之间有着广泛的相互作用,并共同调节GSC干性及致瘤性.
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适度低氧微环境对体外培养脑胶质瘤干细胞生长的影响
目的 探讨低氧微环境对脑胶质瘤干细胞(GSCs)凋亡及增殖的影响.方法 原代培养脑胶质瘤干细胞,特殊培养基筛选;将GSCs分常氧组(21％02)和低氧组(3％02),给予不同的氧浓度,倒置显微镜下观察细胞形态、荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞凋亡、MTT法检测细胞增殖情况.结果 倒置显微镜下可见低氧组细胞较常氧组生长更好;荧光显微镜下2组细胞的胞核形态完好,无凋亡像;流式细胞仪检测,与常氧组相比,低氧组细胞凋亡率无差异(P＞0.05);MTT示:于72 h、96 h及120 h时低氧组较常氧组明显增殖(P＜0.05).结论 适度低氧不会诱导脑胶质瘤干细胞凋亡;适度低氧微环境对胶质瘤干细胞有促增殖作用.
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人脑胶质瘤干细胞增殖相关基因的差异表达
目的：探讨增殖相关基因在胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞中的表达差异。方法分离培养人脑胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞，Trizol法提取细胞总RNA，实时荧光定量PCR检测SHH、EGFR和BCL2L12基因在胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞中表达的情况并分析其表达差异。结果 SHH、EGFR和BCL2L1基因在胶质瘤干细胞中的表达均高于胶质瘤细胞（P＜0．001）。结论增殖相关基因在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞中的表达存在差异，为针对胶质瘤干细胞的脑胶质瘤基因治疗提供了理论依据。
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脑胶质瘤干细胞的研究进展
胶质瘤是人类死亡率高的肿瘤之一,其生长迅速、浸润性强且易复发,其中位生存期不到12个月.虽然目前以手术切除为主放化疗为辅的胶质瘤综合治疗水平不断提高,但胶质瘤治疗效果仍不理想,预后差,是困扰临床医师的难题.目前研究认为,脑胶质瘤中存在一小部分细胞,它们对治疗具有抵抗性,且具有再次形成肿瘤的能力,可能是肿瘤复发的根源,为此提出了胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)的概念.
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胶质瘤干细胞、肿瘤相关巨噬细胞和B7-H1在脑胶质瘤组织中的表达及其意义
目的:探讨胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)和负性共刺激分子B7-H1(B7 homolog 1)在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达及其相关性.方法:对30例低级别脑胶质瘤(WHO Ⅰ级、Ⅱ级)和30例高级别脑胶质瘤(WHOⅢ级、Ⅳ级)标本做连续石蜡包埋切片,用免疫组化SP法检测各组标本中GSCs、TAMs和B7-H1的表达情况,采用CD133作为GSCs的标志物,以CD68作为TAMs的标志物.用Image-Pro Plus 6.0软件分析每个视野阳性染色的积分光密度(IOD),每个组织切片在400倍镜下分析20个视野.结果:CD133、CD68和B7-H1在高级别脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别脑胶质瘤组织(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01);脑胶质瘤组织中B7-H1的空间表达位置在CD68+ TAMs的分布区域较强;CD133与CD68的表达呈正相关(P＜0.001),CD133与B7-H1的表达呈正相关(P ＜0.001).结论:随着病理级别的增高,脑胶质瘤组织中GSCs、TAMs和B7-H1的表达均增高,并且CD133与CD68和B7-H1的表达呈显著正相关.
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CDK2调控ALDH1A3介导原神经-间质转化促进胶质瘤干细胞增殖的机制研究
目的:研究细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)促进胶质瘤干细胞(GSCs)增殖和诱导原神经-间质转化的作用机制.方法:利用生物信息学方法对GSCs中CDK2的表达水平进行分析,并利用shRNA沉默CDK2的表达以探究其促进GSCs增殖的作用;建立GSCs原神经-间质转换(PMT)模型,并对CDK2介导PMT的下游靶点和机制进行预测和验证.结果:CDK2在GSCs中高表达,而特异性沉默CDK2能够显著抑制GSCs生长(P＜0.01).当GSCs接受放射处理后CDK2和ALDH1 A3表达显著上调,而CDK2沉默能够显著下调ALDH1A3的表达.E2F1是和CDK2表达关联性高的ALDH1A3启动子区域结合蛋白,而利用shRNA沉默CDK2能够下调GSCs中E2F1和ALDH1A3的表达水平.结论:CDK2能够通过调节E2F1的表达激活ALDH1 A3的启动子活性并调控其表达和功能,进而调控GSCs的生长并诱导GSCs发生PMT.
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紫杉醇在TRAIL诱导脑胶质瘤干细胞凋亡中的增敏作用研究
目的:探讨体外试验中紫杉醇(PX)能否增强胶质瘤干细胞(GSCs)对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导细胞凋亡的敏感性及其可能的机制.方法:悬浮培养法从U87细胞中培养出GSCs并鉴定.MTT法检测不同浓度的单药PX组、单药TRAIL组和PX与TRAIL联合给药组及序贯给药组对GSCs的抑制作用；流式细胞法检测不同给药方案对GSCs凋亡的影响,Western blot法检测细胞凋亡级联反应的相关蛋白表达变化.结果:TRAIL与PX对GSCs的增殖抑制作用均较低.两药同时联合应用未见协同作用；若PX与TRAIL先后序贯给药则出现协同作用(CDI=0.80).与单独用药组相比,PX与TRAIL序贯给药可显著提高GSCs的凋亡率(P＜0.001),提示PX可提高GSCs对TRAIL的敏感性.蛋白检测发现死亡受体(DR)4、半胱天冬酶(caspase)8和3表达明显上调(P＜0.01).结论:PX与TRAIL序贯给药后PX可能上调DR4的表达,提高GSCs对TRAIL的敏感性,并激活外源性凋亡途径caspase-8及caspase-3诱导细胞凋亡.PX与TRAIL序贯用药对GSCs有一定的诱导凋亡作用.
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胶质瘤干细胞的分离、培养及初步鉴定
目的：探讨人脑胶质瘤干细胞的培养和分离方法。方法：取9例脑胶质瘤患者的手术标本进行处理，采用 B27培养基进行培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果：9例标本中共有7例成功培养出肿瘤细胞球，培养条件下呈悬浮状态生长，形成肿瘤细胞球，免疫细胞化学检测显示肿瘤球细胞表达胶质瘤干细胞的标志物 CD133和 Nestin，诱导分化后的肿瘤球细胞可以表达成熟神经细胞的标志物 GFAP 和 TU －20。结论：体外的培养条件下，可以从胶质瘤组织中培养出胶质瘤干细胞，为胶质瘤的深入研究奠定基础。
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低剂量内皮－单核细胞激活多肽Ⅱ对人 U87MG 胶质瘤干细胞迁移和侵袭能力的影响
目的：研究低剂量内皮－单核细胞激活多肽Ⅱ（EMAP Ⅱ）对脑胶质瘤干细胞（GSCs）迁移和侵袭能力的影响及相关分子机制。方法：应用免疫荧光方法对分离提取的细胞球进行干细胞表面标志性分子 CD133和 nestin 的检测。EMAP Ⅱ（0．05nmol／L）处理 GSCs 后，采用 Transwell 小室实验及 Matrigel Transwell 小室实验检测 GSCs 迁移和侵袭能力的变化；应用 Western blot 方法检测 PI3K 和 p －PI3K 的表达变化；应用胰岛素样生长因子（IGF －1）检测 EMAP Ⅱ作用下 GSCs 迁移和侵袭能力的改变。结果：分离提取的细胞球表面CD133和 nestin 呈阳性表达；EMAP Ⅱ作用0．5h 和1h 时产生了对 GSCs 迁移和侵袭能力的抑制作用；与EMAP Ⅱ作用0h 组相比，PI3K 的表达无变化，p －PI3K 的表达在 EMAP Ⅱ作用0．5h 和1h 时显著下降；此外， IGF －1明显阻断了 EMAP Ⅱ对 GSCs 迁移和侵袭能力的抑制作用。结论：EMAP Ⅱ能明显抑制 GSCs 的迁移和侵袭能力，其机制可能与 p －PI3K 的表达下调有关。
关键词： 内皮 -单核细胞激活多肽Ⅱ 胶质瘤干细胞 迁移和侵袭 -
活性氧自由基参与胶质瘤干细胞辐射耐受的机制研究进展
神经胶质瘤是临床上多发的颅内原发肿瘤,其中恶性胶质瘤具有分化程度低、细胞增殖活跃、侵袭性强等特点.目前的临床治疗手段与预后均不理想,外科手术不能完全切除,肿瘤对放疗和化疗呈现抵抗,肿瘤复发和转移的病例多见.在手术加放、化疗治疗后,中位生存期仅14.6个月,五年生存率不到5％,因此恶性胶质瘤是对健康危害极大的肿瘤[1,2].近年研究表明,肿瘤干细胞的存在是肿瘤辐射抵抗、肿瘤复发和转移的重要原因.本文针对胶质瘤干细胞(Glioma stem cell,GSC)的研究进行文献回顾,着重分析肿瘤干细胞的辐射耐受反应及其活性氧自由基分子(Reactive oxygen species,ROS)的可能参与机制.
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亚甲蓝对胶质瘤干细胞增殖作用的影响
目的 研究亚甲蓝(MB)对胶质瘤干细胞增殖作用的影响.方法 从新鲜人脑胶质母细胞瘤标本中分离脑肿瘤细胞,接种于含生长因子的无血清改良Eagle培养基/F-12(DMEM/ F-12)培养基中培养至细胞形成干细胞球,用免疫荧光法对其进行检测和鉴定.随机将细胞分为四组:正常对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组.采用生长曲线法,软琼脂克隆形成法检测亚甲蓝对胶质瘤干细胞增殖作用的影响,流式细胞仪检测亚甲蓝作用后的胶质瘤干细胞的凋亡情况.结果 生长曲线、集落形成能力结果和凋亡检测结果均显示,与对照组及低剂量组相比,亚甲蓝中、高剂量组细胞的增殖能力明显下降,且亚甲蓝的低有效浓度为1μM,佳有效浓度为10 μM.结论 亚甲蓝可以降低胶质瘤干细胞的增殖能力.
