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PEX基因对C6胶质瘤干细胞MMP-2和VEGF表达的影响
目的 探讨PEX基因对C6胶质瘤干细胞(GSCs)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用血清培养基培养C6胶质瘤细胞系,再取其单细胞悬液悬浮培养于无血清培养基中传代培养.采用单细胞克隆和免疫荧光染色分离鉴定GSCs,运用本实验室成功构建的重组子pDsRed2-C1-PEX,以脂质体为介导转染体外培养的GSCs,逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检验真核表达载体在GSCs中的表达及PEX基因对GSCs表达MMP-2mRNA、VEGFmNA的影响.结果 成功培养出GSCs并成功转染,PEX在GSCs中高表达并且体外对MMP-2、VEGF的表达有明显抑制作用,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PEX基因可以在GSCs中表达,并且体外可以抑制MMP-2和VEGFmRNA在GSCs中的表达,为胶质瘤的治疗奠定理论基础.
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白藜芦醇对脑胶质瘤U87细胞及干细胞凋亡诱导作用
目的 比较研究白黎芦醇(Res)对人脑胶质瘤U87细胞及其胶质瘤干细胞(GSC)的作用.方法 膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)和碘化丙啶(PI)染色法测定细胞凋亡；CD133标记、CD133与Annexin Ⅴ/PI共标记检测GSC相对含量及GSC的凋亡；实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mdrl基因mRNA表达,流式细胞术(FCM)测定P-糖蛋白(P-gp)的表达；集落形成法(CFU)检测细胞的自我更新和增殖能力.结果 不同浓度的Res显著诱导U87细胞凋亡,抑制U87细胞集落的形成.40～160 μmol/L Res作用后U87细胞群体中CD133+ GSC相对含量显著增高、GSC凋亡细胞数量增加,但GSC对Res的敏感性低于U87群体细胞.Res诱导后U87细胞群体中高表达mdrl/P-gp的细胞显著增高,并与GSC含量的增高基本相一致.结论 白黎芦醇可诱导脑恶性胶质瘤U87群体细胞及其于细胞凋亡.
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恶性胶质瘤中干细胞分离与细胞周期检测
目的 从多形性胶质母细胞瘤组织标本中分离、培养、鉴定胶质瘤干细胞,并检测其所处的细胞周期.方法 采用逐步递减培养基中血清含量的方式从多形性胶质母细胞瘤组织标本中获得悬浮生长的肿瘤球,应用免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞及其分化细胞表面标志物的表达,免疫组化检测裸鼠颅内移植瘤表型.免疫磁珠分选多形性胶质母细胞瘤组织标本中的CD133阳性细胞后立即检测细胞周期.结果 在多形性胶质母细胞瘤组织标本中成功分离出胶质瘤干细胞,在无血清培养液中呈悬浮生长,具有很强的自我更新与繁殖能力,免疫荧光染色显示该细胞表达CD133和巢蛋白,诱导分化后可分化成为神经元、星形胶质细胞与少突胶质细胞.裸鼠颅内移植后可重现亲本肿瘤表型.位于其中的胶质瘤干细胞大多处于G0～G1期.结论 多形性胶质母细胞瘤组织中存在胶质瘤干细胞,相对处于静止状态.
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胶质瘤干细胞的糖代谢特点及临床意义
高级别胶质瘤作为高度恶性的中枢神经系统原发肿瘤,具有致死率高,治疗抵抗,易复发等特点,患者的中位生存期仅在15～ 19个月.具备多向分化等干细胞生物学特征的胶质瘤干细胞的存在,将成为高级别胶质瘤治疗的关键[1].近来肿瘤代谢方式的异常改变受到了广泛关注,例如研究证实,高水平的合成代谢将会驱动胶质瘤的发生发展,一型葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1,GLUT1)及二型已糖激酶(herxokinase2,HK2)等代谢相关蛋白及基因也有望成为新的恶性肿瘤干预靶点[2-3].本文旨在针对胶质瘤干细胞的糖代谢特点及其具备的临床意义作一综述.
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胶质瘤干细胞辐射抗性机制的研究进展
肿瘤是包含不同表型和功能的肿瘤细胞的混合物.在已发现的诸多类型肿瘤中,脑肿瘤是中枢神经系统的重大疾病,通常可以造成患者颅内压升高,压迫脑组织,导致神经系统功能障碍,严重威胁着患者的生命.目前,针对脑肿瘤的治疗手段主要包括手术治疗结合化疗和放疗的方法.由于脑肿瘤侵袭性生长的特点,手术不能达到完全切除的效果;化疗效果由于血脑屏障影响了抗癌药物的充分转运及肿瘤的耐药性而不明显;放射治疗是主要的术后辅助治疗手段,但是由于某些肿瘤细胞对射线具有抵抗性,而加大剂量又会造成对周围正常脑组织的损伤,因此增加肿瘤组织对放射治疗的敏感性对于提高放疗效果和治愈率尤为重要.而胶质瘤干细胞的存在,导致了肿瘤的复发和预后不良,本文针对近年来胶质瘤干细胞的辐射抗性机制研究综述如下.
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胶质瘤干细胞靶向治疗的新领域
胶质瘤是颅内常见的原发中枢神经系统肿瘤,其中多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)占胶质瘤总病例数的一半左右,中位生存期仅14.6个月[1].胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)是形成胶质瘤和启动肿瘤快速增殖的初始细胞,并具有完整的成瘤能力[2].GSCs的主要标志物是细胞分化标志133(cluster of differentiation 133,CD133).近几年还发现多种干细胞特异性标志,如巢蛋白Nestin,八聚体转化因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4),性别决定序列盒(sex determining region Y-box 2,Sox2)和Nanog等[3].
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miRNAs与胶质瘤干细胞耐药性研究进展
脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤,其预后差,死亡率高,极大地威胁着患者的生命.研究表明恶性胶质瘤患者在接受常规综合治疗(手术、放疗、化疗)后,中位生存期也仅一年左右[1,2].2003年Singh等[3]基于肿瘤细胞和干细胞自我更新能力、无限增殖能力和多向分化潜能的相似性,以CD133为标志物,采用免疫磁珠法从胶质瘤标本中分离出与神经干细胞(neural stem cells,NSCs)相似的脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cells,BTSCs)
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胶质瘤干细胞生物学特性研究
本世纪初,Reya等[1]发现在多种实体瘤中均有为数不多的细胞具有无限增殖、自我更新、多向分化等类似干细胞的特征,并由此提出了"肿瘤干细胞假说",该假说认为肿瘤中大部分细胞经过短暂增殖分化后凋亡,只有一小部分细胞具有再生肿瘤的能力,将其与机体其它干细胞作比拟,称之为肿瘤干细胞.
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重视胶质瘤干细胞的表观遗传学研究
多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是成人常见的原发性颅内恶性肿瘤,其恶性程度高,手术联合放、化疗后的平均生存期仅为14.6月[1].GBM呈现出明显的浸润性生长,因而手术难以彻底切除,且GBM血管丰富,对现有放、化疗具有抵抗性,即便采取综合治疗措施,仍难以完全控制肿瘤复发及再生长.针对GBM的高度恶性及治疗现状,近年来肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)理论的日益发展,为深入了解GBM的发病机制、探索有效的治疗方案开辟了新的方向[2].胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)是从GBM中分离出来、具有致瘤性的一类细胞.
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Notch信号途径对胶质瘤干细胞的调控机制研究
神经胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤,大多恶性程度高、侵袭性强.手术治疗目前仍是首选甚至是唯一的治疗手段,但远期效果往往不佳,因而复发率和病死率较高.目前已经发现,在人脑神经胶质瘤中存在具有神经干细胞特征的肿瘤细胞,即胶质瘤干细胞.这些肿瘤干细胞具有增殖快、可分化、易成瘤、耐药耐辐射等特点,因此被视为是胶质瘤恶性表型的根源和潜在的治疗靶点[1].然而,胶质瘤干细胞的调控并不完全清楚.因此寻找到胶质瘤干细胞调控的关键信号途径和核心调控分子是对胶质瘤干细胞进行分子干预的前提.Notch信号途径是正常神经干细胞调控的核心信号途径之一.大量研究表明,Notch信号途径可维持神经干细胞的低分化状态、调控神经干细胞的增殖、凋亡和分化方向,因此在中枢神经系统发育中发挥关键作用.有研究提示Notch信号途径也在胶质瘤干细胞中发挥着重要作用,本文旨在阐述Notch信号途径及其在胶质瘤干细胞中的作用.
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Bcl-2在人脑胶质瘤干细胞样细胞中的表达及病理相关性
目的 检测B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)基因在胶质瘤干细胞样细胞(GSLCs)中的表达水平,并分析Bcl-2与来源胶质瘤恶性程度的相关性.方法 从8例临床标本中培养出GSLCs并鉴定后,检测Bcl-2在GSLCs以及相应原代胶质瘤细胞中的mRNA和蛋白水平并比较分析；此外对GSLCs中Bcl-2水平及来源胶质瘤恶性程度之间的关系进行分析.结果 从8例胶质瘤标本中培养出GSLCs并通过鉴定.实时逆转录酶-聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测显示Bcl-2在GSLCs中的mRNA和蛋白水平均显著高于对应的原代胶质瘤细胞,配对t检验结果分别为P＜0.001和P＜0.005,有统计学意义.此外,Bcl-2的在Ⅳ级脑胶质瘤来源的GSCLs中的表达水平明显高于Ⅲ级脑胶质瘤来源的GSCLs.结论 首次检测并发现GSCLs中Bcl-2的表达水平高于相应的原代胶质瘤细胞,此结果与胶质瘤干细胞(GSCs)特点相符,这可能是GSCs产生治疗耐受性并逃避凋亡的原因之一.以Bcl-2为靶点的抗肿瘤治疗须能诱导GSCs凋亡,才有望治愈胶质瘤.
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Lentivirus介导RNAi抑制人胶质瘤干细胞STAT3基因生物学效应观察
目的 了解慢病毒载体对胶质瘤干细胞的亲嗜性及对靶基因表达的干扰效率,初步探索干扰STAT3基因对胶质瘤干细胞增殖的影响.方法 构建STAT3基因sh是RNA的慢病毒表达载体,经293T细胞包装后,获得可表达STAT3基因shRNA的慢病毒颗粒;活性载体病毒感染人原代胶质瘤干细胞后流式细胞分析细胞感染效率;实时定量多聚酶链反应(PCR)和Western blot检测细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达及活化水平;增殖分析试剂盒测定细胞生长曲线,流式细胞分析细胞周期分布.结果 在病毒感染比率值20:1时慢病毒载体对人原代胶质瘤干细胞的感染效率为98.6%;细胞感染可表达STAT3基因shRNA的载体慢病毒后,STAT3基因mRNA显著下降,抑制率为84.3%,STAT3蛋白表达下降81.5%,活化的pSTAT3下降97.9%;胶质瘤下细胞STAT3表达、活化受抑后细胞生长显著变慢,G1期细胞比例显著增高.结论 慢病毒载体对人原代胶质瘤干细胞有着很高的感染效率,介导的RNAi可显著抑制靶基因的表达与活化,是对人胶质瘤十细胞基因功能研究的理想工具.人胶质瘤干细胞STAT3基因受抑后细胞生长显著变慢,出现G1期阻滞.
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MDR1 shRNA对人脑胶质瘤干细胞多药耐药性实验研究
目的 构建多药耐药基因(MDRl)的短发卡RNA表达质粒,并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的作用.方法 培养脑胶质瘤干细胞;根据MDR1的DNA序列没计shRNA,用Siport xp-1脂质体法转染胶质瘤干细胞.分别采用定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测转染前后MDR1 mRNA和蛋白表达情况;使用活细胞计数试剂盒(CCK-8)对转染后细胞进行药物敏感性试验,评价shRNA对多药耐药性的逆转作用.结果 成功构建MDR1 shRNA表达质粒,转染组MDR1mRNA表达水平有所F降(P＜0.05),转染5 d组下降明显;RT-PCR结果显示MDR1 mRNA水平降低,第3、5、7 d抑制率分别为78.46%±14.17%,82.02%±11.87%,79.5%±13.27%.Western blot结果显示:shRNA转染组P-糖蛋白(P-gP)的表达降低,第3、5、7 d抑制率分别为58.1%±6.5%,39.5%±5.2%,45.8%±8.6%;而药敏实验显示:阿霉素、长春新碱对转染MDR1 shRNA的胶质瘤干细胞的半数抑制浓度(IC50)均有不同程度降低,且出现凋亡峰(P＜0.05).结论 MDRI短发卡RNA可在转录后水平对多药耐药进行调节,下调MDR1基因表达,提高药物敏感性,诱导细胞凋亡.
关键词： 胶质瘤干细胞 shRNA 多药耐药基因(MDR1) 基因治疗 -
RNAi抑制STAT3表达、活化诱导人胶质瘤干细胞凋亡与分化
目的 抑制人胶质瘤干细胞( GSCs)信号转导活化转录因子3(STAT3)表达、活化,了解STAT3在细胞凋亡、分化调节中的作用.方法 RNAi抑制人GSCs中STAT3表达、活化,流式细胞分析检测细胞凋亡和干细胞比例变化；实时定量多聚酶链反应(PCR)和Weastern-blot检测Bcl-2、BAX、Caspase-3表达；干扰组和对照组GSCs接种裸鼠,观察成瘤情况.结果 干扰组人GSCs凋亡比例(16.03％)显著高于空白组(2.03％)和阴性对照组(3.19％)(P＜0.05),CD133+细胞比例(5.7％)显著低于空白组(92.2％)和阴性对照组(87.7％)；干扰组Bcl-2表达显著低于空白组和阴性对照组(P＜0.05)；裸鼠移植瘤实验中,阴性对照组3只成瘤,而干扰组均未成瘤.结论 抑制人GSCs中STAT3表达、活化,可诱导凋亡,促进分化,抑制其成瘤能力.细胞凋亡增加可能与Bcl-2表达下调有关.
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替莫唑胺通过TGF-β2影响胶质瘤干细胞的侵袭性研究
目的 探讨替莫唑胺能否抑制胶质瘤干细胞(GSCs)和分化的胶质瘤细胞株的侵袭,并降低免疫抑制作用和对转化生长因子-β2(TGF-β2)表达的影响.方法 首先从原代培养胶质瘤干细胞(PCGCs),然后,我们通过免疫组化,细胞侵袭实验来研究替莫唑胺对侵袭力的影响,实时逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法来证明TGF-β2的表达影响.结果 TMZ能够抑制胶质瘤干细胞和原代培养胶质瘤干细胞的侵袭力.此外,TMZ在mRNA和蛋白水平下调TGF-β2的表达.结论 替莫唑胺能够通过影响TGF-β2的表达来抑制胶质瘤干细胞(GSCs)和分化的胶质瘤细胞株的侵袭,并降低他们的免疫抑制作用,替莫唑胺可作为胶质瘤治疗的免疫调节剂.
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肿瘤干细胞niche：肿瘤干细胞及其微环境间的交联
肿瘤干细胞niche作为干细胞存在的基础，是一种特殊的微环境，同时，也是胶质瘤干细胞及其微环境间的交联。胶质瘤干细胞（Glioma stem cells ，GSCs）不仅同肿瘤一起处于特殊的微环境niche中，而且能通过和不同微环境间复杂的交联对niche产生影响，并进一步塑造niche ，从而对胶质瘤干细胞产生影响。胶质瘤干细胞niche作为根除胶质瘤干细胞的疗法的一个治疗的靶标得到了一些研究者的肯定［1］，这就更近一步强调了胶质瘤干细胞微环境对胶质瘤干细胞的核心作用。现在我们对已发现的血管性的niche和缺氧性的niche和在其内部控制胶质瘤干细胞的分子途径的进展做一个回顾。我们提出不同的niche和胶质瘤干细胞是可以相互影响的。
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基质金属蛋白酶对胶质瘤干细胞侵袭的影响分析
目的在体内外环境下，分析并探讨基质金属蛋白酶(MMP)对胶质瘤干细胞(CSCs)侵袭能力的影响。方法使用神经干细胞培养基对原代恶性胶质瘤细胞进行体外分离培养，并对胶质瘤干细胞的细胞亚群进行免疫组织化学染色，并对不同肿瘤细胞亚群中的基质金属蛋白酶的表达进行检测。结果原代恶性胶质瘤细胞被分离培养后，鉴定出非肿瘤干细胞和胶质瘤干细胞，且胶质瘤干细胞较非肿瘤干细胞而言，其侵袭能力明显更强。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在两个细胞的亚群中的表达水平有着显著性的差异，其表达水平均高于基质金属蛋白酶-9(MMP-9)。在胶质瘤干细胞的亚群中，两种基质金属蛋白酶的表达依赖性均随着时间的延长而增强，其中基质金属蛋白酶-9仅存在于胶质瘤干细胞中，且其增长速度明显高于基质金属蛋白酶-2，主要分布于肿瘤的边缘处。结论基质金属蛋白酶能够在不同条件下使胶质瘤干细胞的侵袭能力增强，而基质金属蛋白酶-9能够为抗肿瘤的治疗提供可靠的参考依据，针对基质金属蛋白酶与胶质瘤干细胞的进一步深入研究，有利于抗肿瘤的临床治疗的发展。
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胶质瘤干细胞表型维持机制研究进展
胶质瘤干细胞(GSCs)具有自我更新、形成神经球、表达干细胞标志物、多向分化、较高侵袭力、放化疗抵抗等特性,这些特性被认为是胶质瘤复发的主要因素.GSCs作为胶质瘤治疗的重要靶标,主要是通过抑制维持GSC干性所需的细胞表面标志物的表达以及阻断相关特异性分子通路,从而减少GSCs增殖,促进其分化,降低其致瘤性来杀伤GSCs.近年来,GSCs与其所处的血管周围/增生性微环境以及缺氧/周围坏死性微环境的相互作用逐渐被关注.研究发现血管周围微环境及坏死周围缺氧区域中,存在一些分子和细胞,通过分子信号转导机制,增强GSCs的干细胞样特性,促进了这些细胞的侵袭和转移,使GSCs在治疗中幸存.因此深入了解这一机制,破坏这些微环境,寻找新的靶点,可以为胶质瘤的治疗开辟一条新的路径.
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Notch信号通路对胶质瘤干细胞 作用机制的研究进展
胶质母细胞瘤(GBM)是成人常见的原发性颅内恶性肿瘤,由于其呈浸润性生长、手术无法彻底切除以及放化疗抵抗等因素,导致临床病情进展快、预后差.近年来多项临床研究表明GBM的侵袭性、高复发性与胶质瘤干细胞(GSCs)存在关联.Notch信号通路参与维持GSCs的特性,调控GSCs的增殖、分化和凋亡.抑制Notch信号通路靶向作用GSCs的临床治疗具有广阔前景.本文综述了GSCs的生物学特征以及Notch信号通路对GSCs的调控机制,拟为GBM的诊断、治疗和科学研究提供新的方向.
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胶质瘤干祖细胞诱导裸小鼠脉络丛细胞癌变的研究
背景与目的:探讨胶质瘤干祖细胞经荧光裸小鼠脑内移植后定居在脉络丛细胞并诱导其上皮细胞癌变的可能性及细胞融合在其中发挥的作用.方法:将人胶质瘤干细胞SU-3和标记红色荧光染料CM-Dil的鼠脑胶质瘤细胞系C6移植于表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠脑内,用传统病理、分子免疫病理和荧光示踪技术对肿瘤细胞在宿主脑内侵袭对不同部位形成的肿瘤团块进行病理学分析.结果:接受尾状核移植的35只鼠和小脑移植的15只鼠全部致瘤,有6只尾状核移植鼠在侧脑室和第三脑室脉络丛见到肿瘤,有5只尾状核移植鼠在第三脑室脉络丛见到肿瘤,有5只小脑移植者在第四脑室脉络丛见到肿瘤.传统病理:肿瘤细胞和组织结构异形十分明显,细胞高度增生,一类是脉络丛结构基本保留,另一类是完全消失.荧光示踪:肿瘤团块中的细胞成分分为源于接种的肿瘤细胞(红色)、源于宿主的细胞(绿色)和两者的融合细胞(黄).分子病理:肿瘤细胞高表达Nestin、Ki-67、角蛋白和GFAP.结论:根据癌干细胞(cancer stem cells,CSCs)定居于不同部位的形态学特征,尤其在脉络丛上形成的能表达相关标志蛋白的脉络丛癌样结构肿块,表明胶质瘤干细胞在特定环境下可诱导宿主细胞癌变,这一过程可能是通过细胞融合实现的,这对进一步研究胶质瘤干细胞分化走向和与宿主组织重构受定居地微生态环境影响有重要意义.
关键词： 胶质瘤干细胞 荧光示踪可移植性肿瘤 细胞融合 脉络丛肿瘤 肿瘤微生态环境
