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慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究
目的 探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导红色荧光蛋白(RFP)基因转染人脑胶质瘤干细胞可行性和试验方法.方法用无血清干细胞培养基培养人脑胶质瘤干细胞,然后用细胞免疫荧光染色检测其干细胞特性表面标志物CD133、Nestin表达情况.以HIV-1来源的慢病毒为载体,以RFP基因为目的 的基因转染人脑胶质瘤干细胞,荧光显微镜下观察RFP阳性细胞表达情况及其转染率.MTT法检测转染后细胞与未转染RFP细胞组细胞增殖情况.再次用细胞免疫荧光染色检测转染后脑胶质瘤干细胞表面标志物CD133、Nestin表达情况.结果 红色荧光慢病毒转染胶质瘤干细胞体外连续培养后,RFP在干细胞中稳定表达,在荧光显微镜下即发出红色荧光,并且转染效率高.RFP- lentivirus转染后干细胞与未转染RFP组比较,生长曲线无明显差异,且转染后干细胞表面标志物仍表达阳性.结论 采用HIV-1来源的慢病毒载体介导以RFP基因为生物标记物标记人脑胶质瘤干细胞是可行的,以慢病毒转染对干细胞的生长影响小,转染效率高.
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胶质瘤干细胞与神经干细胞研究进展
1 研究背景多年来,对胶质瘤分子病因研究集中在基因突变体,虽已取得了长足的进步,但已知的突变体多达数十个,究竟是何种突变体,作用于何种细胞,产生何种类型的肿瘤,尚未有足够的实验数据佐证.
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胶质瘤分子病因研究
随着高通量分子生物技术的完善,寻找胶质瘤确切的分子病因成为可能.在基因工程鼠模型制作过程中发现了多个癌基因和抑癌基因的敲除、转入或转染后发生了类似人类的恶性浸润性胶质瘤,但所谓的"癌前期变"的责任分子尚未明确.胶质瘤干细胞的研究成功和迅速发展为之开拓了新途径.胶质瘤干细胞、神经干细胞和正常胶质细胞三者间能否转化、转化条件的探索是当今研究的胶质瘤分子病因的新策略.在神经干细胞向胶质瘤干细胞演变过程中寻找上述的责任分子是研究者看好的新途径.
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七氟烷通过激活低氧诱导因子途径对胶质瘤干细胞增殖的影响
目的 探讨体外环境下,七氟烷对胶质瘤干细胞增殖的影响.方法 由手术标本获取并培养胶质瘤干细胞,研究七氟烷处理后干细胞增殖改变,并检测七氟烷处理前后干细胞内CD133、低氧诱导因子(HIF)-1α、HIF-2α以及蛋白激酶(p-Akt)的表达变化情况.结果 七氟烷处理后,胶质瘤干细胞增殖显著增快,细胞内HIF-1α、HIF-2α以及p-Akt的表达呈时间及浓度依赖性上升,CD133表达水平无显著改变.结论 七氟烷可通过激活PI3K/Akt途径,上调HIF-1α和 HIF-2α的表达,促进胶质瘤干细胞的增殖.
关键词： 七氟烷 胶质瘤干细胞 细胞增殖 PI3K/Akt途径 -
利用C6胶质瘤干细胞立体定向建立大鼠脑胶质瘤模型
目的 利用C6胶质瘤干细胞建立wistar大鼠脑胶质瘤模型,观察肿瘤生长规律及病理特征,探讨利用肿瘤干细胞构建模型的优势.方法 体外提取并培养C6细胞系中胶质瘤干细胞,应用立体定向法在鼠脑右侧尾状核区接种104个胶质瘤干细胞,术后连续观察大鼠生存状态和生存时间,分时段行鼠脑MRI检查、病理HE切片及GFAP免疫组织化学检查,观察肿瘤生长及病理特征.结果 利用本方法建立模型成瘤率为100％,术后大鼠恢复快,术后反应轻,未见颅外转移,生存期稳定,重复性好,肿瘤生长规律、影像学特征及组织病理特点与人脑胶质瘤相似.结论 利用胶质瘤干细胞建立的大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,肿瘤生长更贴近胶质瘤在脑内自然发生的特点,且较传统方法脑内注射体积小,模型制作时间短,术后恢复快,成瘤率更高等优点,为研究胶质瘤干细胞在肿瘤形成过程中的生长方式、分子机制及实验性治疗提供了一个较为理想的模型.
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胶质瘤干细胞耐药相关机制
胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)具有自我更新和无限增殖的潜能,是引起肿瘤侵袭、增殖、转移、耐药及复发的根源.GSC的高耐药性是恶性胶质瘤化疗效果不佳的重要原因.GSC的多药耐药与ATP结合核转运蛋白、六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶、凋亡抑制蛋白、干细胞巢与血管生成拟态等密切相关,本文对GSC的耐药机制和相关因素进行综述.
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利用C6胶质瘤干细胞建立小鼠脑胶质瘤模型及评价
目的：利用C6胶质瘤干细胞建立ICR小鼠动物模型，为深入研究胶质瘤干细胞在脑胶质瘤中的作用提供理想的模型。方法采用悬浮生长法体外培养C6胶质瘤干细胞，用Nestin巢蛋白抗体进行鉴别；利用C6干细胞建立ICR小鼠脑胶质瘤模型，考察小鼠术后的生存状态和肿瘤体积变化；通过HE染色及CD133免疫组化考察小鼠术后的病理学变化。结果 C6胶质瘤干细胞中Nestin表达量为96．01%， Nestin在所培养的C6胶质瘤干细胞球中高表达；小鼠接种肿瘤后食欲不振，体质量偏轻，且行为缓慢，反应呆滞；建模21 d时肿瘤体积为(9．77±6．58) mm3；模型经HE染色后可见脑组织呈浸润性生长，肿瘤细胞核皱缩，排列紊乱；免疫组化CD133染色显示肿瘤细胞胞质显棕色，肿瘤组织中存在大量的脑胶质瘤干细胞。结论利用胶质瘤干细胞建立的脑胶质瘤模型成瘤率高，成瘤周期短，可作为后期脑胶质瘤模型的理想模型。
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紫草素对脑胶质瘤干细胞干性维持的相关研究
目的：研究紫草素对脑胶质瘤干细胞(GSCs)干性维持的影响及相关分子机制。方法应用免疫荧光方法对分离提取的细胞球进行干细胞表面标志性分子 CD133和 nes-tin 的检测；紫草素(2μmol·L -1)处理 GSCs 12、24和48 h后,光镜下观察紫草素对 GSCs 悬浮细胞球形态的影响；采用亚球形成实验评估紫草素对 GSCs 自我更新能力的影响；应用 Western blot 方法检测紫草素作用下 GSCs 干细胞标志分子 CD133的表达变化,同时检测紫草素作用下,GSCs 中PI3K、p-PI3K、Akt 和 p-Akt 的表达变化；联合应用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)后检测紫草素作用下,GSCs 干性维持的改变。结果分离提取的细胞球表面 CD133和 nestin 呈阳性表达；紫草素能够明显抑制 GSCs 悬浮细胞球的形态和二代细胞球的形成,同时能够降低 CD133的表达；与对照组相比,紫草素作用下,GSCs 中 PI3K 和 Akt 的表达无变化,p-PI3K 和 p-Akt 的表达呈现药物时间依赖性明显下降；此外, IGF-1能够明显改善紫草素对 GSCs 干性维持的抑制作用。结论紫草素能够明显抑制 GSCs 的干性维持,其机制可能与 PI3K/ Akt 信号通路有关。
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miR-486对CD133+胶质瘤干细胞的影响
目的 研究miR-486对CD133+胶质瘤干细胞的影响.方法 CD133抗体标记U87胶质瘤细胞系,流式细胞分选纯化CD133+胶质瘤干细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)检测CD133+胶质瘤干细胞中miR-486的表达量.脂质体转染方法构建过表达miR-486的CD133+胶质瘤干细胞,MTT法检测其凋亡率,流式分析仪检测细胞增殖率与生长周期.结果 流式分选后CD133+胶质瘤干细胞纯度从1.7％提升至84.2％ (P ＜0.001),达到实验要求.CD133+ U87胶质瘤细胞中miR-486相对表达量为(0.33±0.10),显著低于CD133+ U87胶质瘤细胞中的miR-486表达量(0.45±0.09)(P＜0.05).转染miR-486模拟物的CD133+胶质瘤干细胞较转染miRNA对照模拟物的CD133+胶质瘤干细胞相对增殖率降低(220％ vs 360％),细胞周期检测对照组细胞位于G0/G1期的比例低于转染miR-486后的细胞(62.8％ vs 76.8％,P＜0.05),转染miR-486后细胞凋亡率显著提高(1.7％ vs 23.2％,P＜0.001).结论 CD133+胶质瘤干细胞中miR-486表达量减少,过表达miR-486的CD133+胶质瘤干细胞增殖受到抑制,生长周期被阻滞于G1/S期,凋亡率显著提高,可能是胶质瘤靶向治疗胶质瘤干细胞的有效靶点.
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HMGA1在由胶质母细胞瘤细胞株U251分得的胶质瘤干细胞中的表达
目的 分析人类胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)细胞株U251和由此分离的胶质瘤干细胞中HMGA1的差异性表达.方法 用MACS柱从U251中分离出表达表面标志物CD133的胶质瘤干细胞(glioblastoma stem cells,GSCs),并用免疫荧光技术和流式细胞分析法对其进行分析.用实时反转录酶-聚合酶链反应技术(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质印迹技术分别探测到两类细胞的HMGA1基因在转录和翻译水平上表达的不同.结果 从U251中分离出GSCs,U251中的GSCs约为0.32％.在GSCs中,HMGA1在转录和翻译水平上分别为U251蛋白的(6.13±0.25)倍和(2.75±0.99)倍.结论 相比于U251,HMGA1在GSCs是过度表达的.HMGA1的过度表达可能与体内肿瘤干细胞的恶性扩增、侵袭和分化密切相关.HMGA1基因可望成为胶质母细胞瘤的一种生物标记物和治疗的靶向目标.
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干扰胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白CPEBs对胶质瘤干细胞侵袭力的影响
目的：分析干扰胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（cytoplasmic polyadenylation element-binding protein ， CPEBs）对胶质瘤干细胞（glioma stem cells ，GSCs）侵袭力的影响。方法对 GSCs 进行原代培养，分为实验组、对照组及空白组，实验组接受 CPEBs 干扰处理，对照组接受空载体转染，空白组正常培养，通过细胞侵袭实验比较各组细胞侵袭力的变化。结果通过 Western blot 检测可见，siRNA-3对 CPEBs 干扰效果佳；显微镜下可见，受慢病毒感染的实验组细胞呈绿色荧光表达，表达率70％以上；Western blot 检测可见，受慢病毒感染的实验组 CPEBs 蛋白表达量显著低于对照组与空白组（P＜0.05）；处理48 h 后，实验组细胞凋亡率达到21.43％，显著高于空白组的0.51％及对照组的1.43％（P＜0.05）；M TT 检测结果可见，处理3 d 后，实验组细胞生长速度显著降低，且低于对照组与空白组（P＜0.05）；Transwell 侵袭实验结果示，实验组细胞穿膜数量显著低于对照组与空白组（P＜0.05）。结论干扰 CBEPs 后胶质瘤干细胞生长、增殖、侵袭能力均得到大幅度抑制，为胶质瘤的靶向治疗提供了新的靶点研究方向，有望在改善胶质瘤患者预后方面发挥重要作用。
关键词： 胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白 胶质瘤干细胞 侵袭力 -
神经胶质瘤干细胞研究及临床治疗新进展
脑胶质瘤是神经外科常见疾病,生长迅速,且5年生存率很低.据2009年美国癌症协会报道,美国每年有18 000例原发性脑肿瘤确诊病例,仅1/3病例存活超过5年;其中多形性胶质母细胞瘤是人类恶性程度高的癌症之一.尽管强化治疗,胶质母细胞瘤患者的平均存活时间仅1年左右[1].临床上相当一部分患者放疗和化疗后又复发,不少学者提出了肿瘤干细胞学说.脑胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)是脑胶质瘤的"种子"细胞,具有自我更新、增殖和多向分化潜能等干细胞属性.它与神经干细胞有许多相似的生物学特性,但又明显不同于神经干细胞,胶质瘤干细胞是胶质瘤发生、生长、转移等的根本因素,能有效的控制并杀死肿瘤干细胞,才能从根本上解决肿瘤的根源问题.
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胶质瘤干细胞研究现状
恶性胶质瘤是一种常见的原发性神经肿瘤,目前尚无有效的治疗方法,且预后差复发率高,严重威胁着人类的健康.近年来,越来越多证据发现胶质瘤组织存在类似神经干细胞特性的细胞,并由此提出了胶质瘤干细胞理论,使胶质瘤研究进入了新的阶段.通过对胶质瘤干细胞的深入研究,人们对此类肿瘤有了更全面的认识,这也给疾病的治愈带来了希望.着重从胶质瘤干细胞的特异性生物学标记物、生物学特征、细胞起源等方面进行综述.
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U251胶质瘤干细胞抗辐射性能研究
目的 从U251细胞株中分离胶质瘤干细胞并探讨胶质瘤干细胞的抗辐射性能.方法 应用无血清培养基悬浮培养法从U251细胞株中分离鉴定胶质瘤干细胞,X线辐射处理72 h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,流式细胞仪及免疫荧光染色法检测辐射前后CD133和三磷酸腺苷结合盒转运体成员2 (ABCG2)的表达.结果 U251细胞株中经过无血清培养可以得到悬浮生长的胶质瘤细胞球,具有较强的自我更新和增殖能力；在细胞球中,有3.17％的细胞表达CD133,1.17％表达ABCG2；9 Gy辐射处理72 h后,CD133表达阳性率上升到13.24％,ABCG2表达阳性率上升到8.76％；辐射处理后,细胞活性随辐射剂量增大而显著下降(P＜0.05).结论 悬浮培养法得到的肿瘤细胞球有小部分是胶质瘤干细胞；X线辐射处理后,细胞活性随辐射剂量增大而显著下降；胶质瘤干细胞表现出更强的抗辐射损伤性能.
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胶质瘤干细胞疫苗治疗恶性脑胶质瘤
利用自体树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤的主动免疫治疗方法 前景广阔[1].我们以胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞(DC),诱导特异性T细胞,并检测其对胶质瘤细胞杀伤能力,探讨其作用机制.
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脑胶质瘤干细胞的培养和鉴定
肿瘤干细胞和肿瘤的发生、进展和预后密切相关[1].我们应用脑胶质瘤细胞株U251,证实人脑胶质瘤干细胞的存在.一、材料与方法1.材料:人脑胶质瘤细胞株U251(购自中国科学院细胞库).DMEM/F12培养基(Hyclone),EGF(Peprotech),FGF(Peprotech),LIF(Millipore),1327(Invitro-gen),鼠抗人Nestin单抗(中杉金桥),鼠抗人MAP2单抗(Sigma),鼠抗人PE-CD133单抗(eBioscience),兔抗人GFAP单抗(BIOSS),逆转录试剂盒(Toyobo),SYBR Green mix(Toyobo),等.
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U-251人胶质瘤细胞及其肿瘤干细胞的基因表达差异分析研究
近年来,随着脑肿瘤的深入研究,一些研究者相继提出了脑肿瘤干细胞(BTSC)的概念,并通过研究证实了BTSC的存在[1].我们应用基因芯片技术初步分析了U-251胶质瘤干细胞的基因表达谱,现将结果报道如下.
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胶质瘤干祖细胞与巨噬细胞的社会活动:细胞连接、融合及胞释
目的 通过分析免疫细胞社会中的肿瘤细胞与宿主巨噬细胞之间的关系,探寻肿瘤细胞社会中打破免疫平衡的大事件.方法 共培养红绿双色荧光示踪的胶质瘤干/祖细胞与宿主巨噬细胞,置于活细胞工作站实时摄影缩时成像并视频分析目标细胞的社会行为.结果 相关细胞实时动态连续观察发现:(1)细胞间传递信息的连接管道的6种类型.(2)2个活跃细胞相互作用后变成1个细胞,即细胞融合;已融合的细胞与另一个细胞再融合.(3)融合细胞的命运有对称分裂产生子细胞和瞬间凋亡两种.(4)存在一个细胞进入另一细胞内后胞释现象.结论 胶质瘤干/祖细胞与宿主巨噬细胞间连接方式、融合、分裂及胞释过程,可作为胶质瘤干/祖细胞诱导宿主巨噬细胞恶变的细胞行为学依据,对进一步理解肿瘤细胞社会成员间的复杂关系有重要意义.
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整合素β3促进胶质瘤干细胞管样结构形成的研究
目的 观察整合素β3在胶质瘤肿瘤干细胞(GSCs)的肿瘤血管生成中的作用.方法 分离培养GSC1和GSC2,制备人间质干细胞(hMSCs)条件培养基(hMSC-CM),分别在神经干细胞( NSC)培养基和hMSC-CM中培养,观察管样结构形成结果；通过Western blot法检测NSC和hMSC-CM培养条件下整合素的表达；通过脂质体转染小干扰RNA(siRNA)对GSC1的整合素β3进行RNA干扰,检测RNA干扰后GSCl的管样结构形成.结果 GSC1在hMSC-CM培养下可以观察到类似管样结构形成,Western blot法检测结果显示GSC1在hMSC-CM培养7d时整合素β3表达明显高于NSC培养,siRNA干扰可以下调GSC1的整合素β3表达,影响了GSC1在hMSC-CM中形成管样结构.结论 整合素β3在GSC1体外血管生成中起重要作用.
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胶质瘤干细胞趋化神经干细胞迁移及其机制研究
目的 观察神经干细胞( NSC)向胶质瘤干细胞(GSC)及其分化细胞的迁移能力,探讨其趋化机制。方法 干细胞条件培养U251和3例原代胶质瘤干细胞,以流式细胞术和Western blot对其鉴定;Transwell小室法检测GSC和其分化细胞条件培养液(CM)对NSC迁移的趋化能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测CM中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌水平,并以表皮生长因子(EGF)、bFGF为对照分析CM对NSC的化学趋化作用;进一步以Dio和Dil分别标记NSC和GSC,体外混合培养观察NSC向GSC的迁移、以及对肿瘤干细胞球生长的影响。结果 干细胞培养条件下的胶质瘤干细胞球,高表达干细胞标志物Nestin和/或CD133( 11.02％～ 33.55％);分化后干细胞标志物表达下降,分化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加(P＜0.05);GSC与其分化细胞比较,分泌高水平的趋化因子VEGF和bFGF(P ＜0.05),并对NSC有高度趋化能力;体外混合接触培养也显示NSC向肿瘤干细胞球的迁移和包绕,并且能够显著抑制肿瘤干细胞球的生长(P＜0.05)。结论 GSC体外可趋化NSC向其迁移,其趋化作用较分化的肿瘤细胞更为显著,并且与其分泌高水平的生长因子有关;向肿瘤干细胞球迁移的NSC可抑制其体外生长。
