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HIV特异性CTL反应研究进展
HIV原发感染可以诱发强烈的特异性CTL反应.HIV特异性CTL可以直接裂解病毒感染的细胞、分泌IFN等细胞因子抑制病毒的复制或分泌趋化因子阻断病毒进入靶细胞,从而抑制的HIV复制.但随着疾病的进展,已建立的细胞免疫反应逐渐丧失对HIV的控制,机体免疫系统崩溃并终导致AIDS的产生.HIV感染过程中特异性CTL确切的保护机制以及慢性期CTL功能受损的具体原因还不完全清楚,对这些问题继续深入的探讨无疑对HIV疫苗和免疫治疗研究具有重要意义.
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HIV-1疫苗免疫原设计的研究进展
至今,艾滋病仍是人类历史上严重的传染病之一.设计和生产具有保护效力的预防型HIV-1疫苗一直被认为是战胜艾滋病的佳途径.虽然经过了数十年的努力,但有效的HIV-1疫苗仍未研制成功.在进入临床试验的5种疫苗中,只有RV144实验显示出31％的保护效力,但并不能控制已感染者病情进程.通过临床实验数据和体外实验分析,目前主要有两种免疫原设计策略:诱导广谱中和抗体(bNAb)和有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.诱导bNAb可以阻止病毒感染或者降低感染率,其主要免疫原包括:病毒样颗粒、天然包膜蛋白三聚体和稳定的bNAb结合表位等.而诱导有效的CTL应答可以减缓病毒感染进程,其主要免疫原包括:“马赛克”疫苗、保守区免疫原和病毒适应性图谱指导的免疫原等.本文将主要阐述这两种免疫原设计策略及其研究进展.
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含EBV-LMP2基因重组腺病毒修饰的树突状细胞疫苗体内外特异性抗瘤作用的研究
鼻咽癌(NPC)在东南亚地区,尤其在我国南方地区发病率高达40/10万～60/10万.Epstein-Barr virus(EBV)在鼻咽癌的病因学中有着十分重要的作用,在肿瘤细胞中该病毒的存在为以CTL为基础的免疫治疗提供了一个潜在靶位.
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青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞负载树突状细胞后的免疫应答
本研究探讨凋亡白血病细胞负载的树突状细胞(dendritic cells,DC)能否诱导特异性细胞毒T淋巴细胞反应.用青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡,从正常人外周血单个核细胞诱生DC,将凋亡U937细胞负载DC,并添加TNF-α诱导DC成熟,然后与自体T淋巴细胞共育,并联合IL-2以诱生细胞毒性T淋巴细胞(CTL);应用流式细胞术分析DC和T细胞免疫表型,采用Dextran-FITC内吞试验检测DC的抗原摄取能力;用ELISA法检测Il-12p70的产生;采用MTT法检测凋亡U937细胞负载及未负载DC诱导的自体T淋巴细胞对不同的靶细胞(U937细胞和NB4细胞)的杀伤效应.结果表明:青蒿琥酯1μg/ml作用于U937细胞48小时后,U937细胞的凋亡率达51.52%,DC在未成熟阶段时吞噬Dextran-FITC的能力强,负载凋亡U937细胞之后并不能促使未成熟DC(iDC)分化为成熟DC(mDC).凋亡U937细胞负载后的iDC在TNF-α的作用下能够成为mDC.与未负载的mDC相比,凋亡U937细胞负载后的mDC(mDC-ApoU937)分泌IL-12p70水平明显增高,而且由其所激发和扩增的T细胞以CD8+的T细胞为主.细胞毒性实验显示:mDC-ApoU937诱导的T细胞的对U937细胞的杀伤显著超过对NB4细胞的杀伤.结论:mDC-ApoU937能有效地诱导特异性抗白血病效应.
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抗原致敏、GM-CSF基因修饰的树突状细胞诱导免疫杀伤多发性骨髓瘤细胞U266的研究
本研究探讨负载有多发性骨髓瘤细胞U266可溶性抗原并携带外源基因粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的树突状细胞(DC),在体外激活自身T淋巴细胞形成细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对U266细胞的杀伤作用.用U266可溶性抗原致敏DC,再用含有外源基因GM-CSF的腺病毒感染DC,将所得的DC与T细胞混合培养以形成对U266具有特异杀伤作用的CTL,后通过测定乳酸脱氢酶(LDH)以计算CTL对U266的杀伤率.结果表明:负载抗原及外源基因组、负载抗原组和对照组之间的杀伤率存在显著差异(n=3,F:10.939,P<0.05);两两比较表明,负载抗原及外源基因组的杀伤率高于其它两组(P<0.001),且负载抗原组高于对照组(P<0.001).结论:以U266可溶性抗原致敏的DC可诱导出对U266具有特异杀伤作用的CTL,当所致敏的DC通过腺病毒感染而带有外源基因GM-CSF时,所诱导的细胞毒杀伤反应则进一步增强.
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人鼠嵌合型CD20单克隆抗体增强树突状细胞诱导抗淋巴瘤CTL免疫效应研究
本研究利用人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤的靶向作用特点和其人源Fc段结合人树突状细胞(DC)的特点,探讨抗CD20单克隆抗体激发人DC呈递肿瘤抗原从而诱导抗淋巴瘤的细胞免疫效应.用人体外周血单个核细胞(MNC)体外诱导DC生成.对高表达CD20的人淋巴瘤细胞株(Raji)分别进行抗CD20单克隆抗体单独作用(R组)、加热诱导凋亡(A组)、诱导凋亡同时加用扰CD20单克隆抗体作用(R+A组).经上述处理的肿瘤抗原分别负载于DC,应用透射电子显微镜观察DC对肿瘤抗原的吞噬作用,用抗原处理的DC进行自体混合淋巴细胞反应,应用ELISPOT分析效应细胞-干扰素产生和用MTT法分析效应细胞对Raji靶细胞的杀伤作用.结果表明:R组处理的DC无明显吞噬现象,A组中易见DC吞噬凋亡小体,而R+A组中DC吞噬较多的细胞碎片.流式细胞术检测显示,3个实验组DC上的CD80、CD86、HLA-DR表达高于对照组,差别显著(p＜0.05),其中R+A组的CD86表达阳性率明显大于R组和A组(p＜0.05).淋巴细胞表面抗原检测结果显示,所有实验组CD8+细胞的比例均明显高于对照组(p＜0.05),且应用抗CD20单克隆抗体的实验组(R组和R+A组)CD56+细胞数均有所增加,与不用抗CD20单克隆抗体组比较差别显著(p＜0.05).ELISPOT方法证明,各实验组产生γ-干扰素的细胞数均高于对照组,且当效靶比为1∶10时,R+A组斑点数明显高于其它组(p＜0.05).MTT法测定杀伤实验结果表明,各实验组对Raji细胞的杀伤率均较对照组增加,其中R+A组的杀伤率高于R组和A组,具有显著统计学差异(P＜0.05).结论:抗CD20单克隆抗体能够介导DC产生抗淋巴瘤效应,即激活并扩增肿瘤特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK),抗CD20单克隆抗体同时加凋亡诱导处理肿瘤细胞作为抗原冲击树突状细胞,能进一步增强抗淋巴瘤的细胞免疫效应.
关键词： 抗CD20单克隆抗体 树突状细胞 淋巴瘤 CTL NK细胞 -
致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究
探讨脐血单个核细胞(MNC)诱导的树突状细胞(DC)通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HL-60、K562的杀伤作用.取脐血12份,分离MNC.在MNC中加入细胞因子GM-CSF(granulocyte monocyte colony-stimulating factor)、IL-3(interleukin 3)、SCF(stem cell factor)和EPO培养4周.使用CD83、CD1a、CD11c和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况.DC通过负载HL-60、K562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL.3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性.结果表明:新鲜脐血CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+细胞数分别为0.27×105/ml、5.87×105/ml、1.94×105/ml、2.73×105/ml.加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+DC,经培养2-4周,DC数明显增多,分别达11.02×105/ml、28.24×105/ml、10.57×105/ml、18.7×105/ml,此后逐渐减少.细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1:40时的刺激活性佳.冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为(42.04±8.46)%和(31.25±11.07)%,与实验组比较有显著性差异(P<0.01).结论:加入细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+DC.冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用.脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用.
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外泌体联合CpG ODN免疫刺激佐剂诱导CTL抗白血病效应
为了探讨外泌体(exosomes)作为白血病治疗性疫苗的可行性,体外研究了外泌体联合CpG佐剂诱导CTL杀伤白血病细胞的作用.获取正常人外周血MNC-DC,并分为7组,其中3组分别加入K562细胞来源外泌体(Kexo)、K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体(DCexo)及K562细胞冻融抗原冲击K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体(FTexo)作为实验组(分别为Kexo、Dcexo和FTexo);另外3组在加入Kexo、DCexo和FTexo的同时加入CpG ODN佐剂也作为实验组(Kexo+CpG、DCexo+CpG和FTexo+CpG);第7组作为空白对照组.所有7组DC再继续培养3天,然后加入同源正常人T淋巴细胞共同培养3天,诱导T淋巴细胞为效应细胞(CTL),K562细胞为靶细胞,用MTT法测CTL对K562细胞的杀伤活性.结果显示:各外泌体实验组刺激诱导的CTL的杀伤作用比对照组明显增强(P<0.05).DCexo及FTexo诱导的CTL对K562靶细胞的杀伤作用比Kexo强(P<0.05),联合应用GPG ODN佐剂可以进一步增强这种杀伤作用(P<0.05).结论:外泌体能诱导有效的CTL对白血病靶细胞的杀伤作用,CPG ODN佐剂能进一步增强这种杀伤作用,外泌体有望作为治疗性疫苗用于白血病的临床治疗.
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免疫活性细胞回输前后HCV滴度及C区和E2区CTL表位变化
目的观察免疫活性细胞回输前后慢性丙型肝炎患者外周血丙型肝炎病毒(HCV)滴度及C区和E2区CTL表位的变化情况.方法定量PCR检测4例接受免疫活性细胞回输的慢性丙型肝炎患者外周血HCV滴度,并利用分子克隆、基因测序和计算机辅助分析技术分析不同时间点不同分离株CTL表位的变化情况.结果 4例患者在接受免疫活性细胞回输前后血清ALT水平存在不同程度波动,其差值从第2例患者的58到第1例患者的198,同时HCV滴度也发生了较大变化,其变化倍数从第3例患者的25.37倍到第4例患者的882.35倍,其对数转换值的波动幅度在1.40～2.94之间.在免疫活性细胞回输后4例患者外周血HCV滴度均出现了不同程度的一过性下降.在全部观察期内HCV C区和E2区的CTL表位编码区均未出现明确的变化.结论机体免疫攻击状态发生改变时可引起患者体内丙型肝炎病毒滴度的变化,但不伴随目前观察的CTL表位编码基因的改变.
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乙肝病毒感染者外周血IL-21表达及意义
在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)小鼠模型的研究中发现,病毒特异性CD8+T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)功能的发挥需要特异性CD4 +T细胞的辅助.IL-21主要由活化的CD4+T细胞分泌,对维持病毒特异性的CTL功能具有重要的作用.本研究在体外观察不同乙肝病毒( HBV)感染状态下,血浆中IL-21的表达及产生IL-21的HBV特异性CD4+T淋巴细胞频数,探讨IL-21在HBV感染中的意义.
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慢性HBV感染者调节性T细胞、黏附细胞对细胞毒T淋巴细胞体外增殖的影响
乙型肝炎患者体内细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)的功能和数量直接影响着病毒的清除和肝细胞的损伤.本实验主要探讨慢性HBV感染者调节性T细胞(Tr)、黏附细胞(AC)对HLA-A2限制的HBV特异性CTL体外增殖的影响.
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高强度聚焦超声制备肿瘤疫苗对小鼠抗肿瘤免疫增强作用的研究
目的 探讨高强度聚焦超声(HIFU)制备的肿瘤疫苗对小鼠抗肿瘤免疫的增强作用.方法 每组小鼠20只,分别以2种声强的HIFU瘤苗、高温瘤苗及生理盐水注射,接种H22细胞后观察小鼠肿瘤发生率及生存期；检测免疫小鼠淋巴细胞的增殖及小鼠细胞毒性淋巴细胞(CTL)对肿瘤的杀伤;观察不同声强对HIFU瘤苗效能的影响.结果 HIFU瘤苗组小鼠肿瘤发生率减低,生存期延长；淋巴细胞在同源肿瘤刺激下增殖明显,CTL对肿瘤细胞有特异性的杀伤,且比高温瘤苗组有更高的增殖率和杀伤率(P＜0.05)；显著提高声强后制备的HIFU瘤苗效能降低.结论 一定参数下制备的HIFU瘤苗明显增强了小鼠抗同源肿瘤的免疫力.
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HBV组织相容性复合物-抗原肽五聚体在特异性细胞毒T淋巴细胞检测中的应用
组织相容性复合物(MHC)-抗原肽五聚体(Pentamer)复合物是目前检测特异性细胞毒T淋巴细胞(eytotoxicT lymphocytes,CTL)为敏感而特异的方法之一,正被广泛应用于多种病毒感染性疾病发病机制的研究以及作为临床感染转归的预测指标.但由于外周血淋巴细胞中特异性CTL的数量非常低,对于如何确定特异性CTL频数存在相当大的困难.
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基于发病机制的原发免疫性血小板减少症治疗新策略
原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是临床常见的出血性疾病,约占出血性疾病的30％.研究表明ITP是一组异质性疾病,机体对自身血小板抗原的免疫失耐受,从而导致自身抗体介导的血小板破坏和细胞毒性T细胞(CTL)介导的血小板溶解是其重要的发病机制之一;而巨核细胞血小板生成不良是新近认识的ITP发病的又一重要机制.近期揭示的一系列新的发病机制为ITP治疗提供了新的靶点.
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乙型肝炎治疗性疫苗研究进展
成人罹患急性乙型肝炎康复后多表现出针对HBV核衣壳(HBcAg)、多聚酶和包膜蛋白(HBsAg)的多克隆抗体和特异性辅助性T细胞(CD4+T细胞)及细胞毒性T细胞(CTL)应答.
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抗癌防转汤抑制肝癌淋巴道转移及其对MMP-9和CTL影响的研究
目的:探讨抗癌防转汤抑制小鼠肝癌淋巴道转移效果及其机制.方法:采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组、荷瘤对照组、低剂量治疗组和高剂量治疗组,建立小鼠肝癌淋巴道转移模型, 计算接种后фi(21 d小鼠抑瘤率)并运用MTT法检测CTL细胞活性及免疫组织化学方法和Western blot检测各组原发瘤及转移瘤基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表达水平,运用统计学分析数据意义.结果:治疗组较对照组,小鼠抑瘤率明显提高,MMP-9在原发瘤、转移瘤表达均减少(P<0.05),细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)活性增强(P<0.05),而且跟药物浓度呈正相关,P<0.05.结论:抗癌防转汤有抑制肝癌淋巴道转移的作用,且其与MMP-9的表达水平降低,CTL细胞活性增强有关.
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树突状细胞疫苗在消化道肿瘤中的应用现状
免疫学治疗恶性肿瘤的研究越来越受到人们的重视,T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中起着主导作用.树突状细胞(DC)在体内外都能诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成~([1]).目前DC疫苗在各类癌症方面的应用研究很深入且广泛.现就近年DC疫苗在消化道肿瘤治疗中的应用现状进行综述.
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癌胚抗原T、B细胞表位短肽诱导特异性体液免疫反应研究
目的 筛选癌胚抗原含T、B细胞表位的短肽并分析其诱导机体产生体液免疫的特性.方法 利用免疫信息学方法预测CEA CTL表位,结合我们早期对CEA B表位预测的结果,选择含多个CTL表位肽和B表位肽的CEA氨基酸序列580～598处短肽作为目的基因.目的基因密码子优化后采用pET32a(+)原核表达系统表达融合蛋白,经SDS - PAGE和Western blot-ting鉴定融合蛋白的抗原性；经镍整合亲和层析柱(Ni - NTA Agarose)纯化CEA580～598全长融合蛋白,纯化蛋白用佐剂乳化后经日本大耳白家兔背部皮下多点免疫注射,采用Western blotting检测血清抗体的特异性,采用ELISA法检测血清抗体水平及变化趋势.结果 含多个T、B细胞表位的短CEA580～598在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的25.6％；表达产物的相对分子质量(Mr)约21kDa,与预期Mr相符；Western blotting分析结果显示,在21kDa处出现特异性条带.日本大耳白兔经CEA580～598融合蛋白免疫后产生高水平的特异性抗体,与空载体和PBS对照组比较具有显著性差异(P＜0.05),制备的免疫血清不但能特异识别CEA580～598短肽,而且能特异识别天然CEA抗原.结论 CEA580～598短肽融合蛋白具有较强的免疫原性,诱导的兔免疫血清能特异性结合CEA抗原,为基于CEA表位疫苗的研究奠定理论和实验基础.
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NS398对卵巢癌细胞系CAOV3免疫杀伤作用的体外研究
目的 观察和探讨COX-2选择性抑制剂NS398对卵巢癌细胞系CAOV3增殖抑制作用及对CTL细胞体外免疫杀伤作用的影响.方法 放射免疫法测定CAOV3细胞及经NS398处理的CAOV3细胞培养上清液中的PGE2含量,流式细胞仪分析CTL细胞表型,MTT比色法检测CTL细胞杀伤活性.结果 NS398能抑制CAOV3细胞分泌PGE2;经NS398处理的CAOV3刺激诱导产生CTL细胞对CAOV3细胞的杀伤活性显著增加.结论 NS398可能成为卵巢癌预防与治疗的新靶点.
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特发性血小板减少性紫癜患者外周血T细胞的杀伤细胞免疫球蛋白样受体表达研究
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer Ig-like receptors,KIR)是近年发现的细胞表面糖蛋白受体,除表达于NK细胞外还表达于部分T细胞,主要为CD8~+ 细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)~[1].
