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HIV-Ⅰ包膜蛋白gp41单克隆抗体的研究进展
HIV-1gp41在病毒侵入早期,发挥重要作用.针对gp41的单克隆抗体作为一种良好的工具广泛地应用于以gp41为靶点的抗HIV-1药物和疫苗研究工作中.
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HBV包膜蛋白与核心蛋白相互作用的研究进展
关于HBV病毒颗粒形成过程的研究很多,本文着重对HBV包膜蛋白的前S1区、胞质侧SLOOP区与核心蛋白的钉突之间相互作用的研究做一综述.
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与HBV进入细胞有关的细胞膜分子
本文对近年有关HBV进入细胞的分子机制的研究做一综述,主要介绍了新发现的与HBV进入细胞有关的细胞膜分子和HBV包膜蛋白的水解机制.
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034 乳铁蛋白抗丙型肝炎病毒的机制及其应用
乳铁蛋白(Lf)是转铁蛋白家族中的一员,具有多种生物学功能.据报道在体外培养细胞中Lf能抑制丙型肝炎病毒感染,并且是由于Lf的第600～605位和第625～632位氨基酸片段与丙型肝炎病毒包膜蛋白E2蛋白质直接作用,破坏丙型肝炎病毒复制.本文对Lf抗丙型肝炎病毒机制及其在临床应用方面的研究现状作一综述.
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利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体
以细胞法从HIV-1 CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体.将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2_NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性.四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920).这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位.我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1 CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24 μg/mL、0.89 μg/mL和3.09μg/mL.其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69 μg/mL 和3.52 μg/mL.提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体.因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台.
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四份中国HCV阳性血清中包膜蛋白E1/E2准种基因的序列分析及新型插入突变的发现
为分析四份中国丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清中包膜蛋白E1/E2基因的准种特征.本研究对从4份中国HCV阳性血清(1b亚型:274、366和383；2a亚型:283)中提取的HCV核酸,采用逆转录-聚合酶反应扩增编码全长E1/E2蛋白(191～764aa)的基因片段,随机挑取多个克隆测序.根据E1/E2基因核苷酸的序列与其他相关序列(来自于GenBank)构建亲缘性关系进化树,进行核苷酸与氨基酸同源性分析并对重要的基因位点进行分析.共获得阳性克隆序列43个(274株10个,283株12个,366株13个,383株8个),发现高变区HVR1、HVR2的基因异质性高,而其他抗体中和表位及跨膜区I、Ⅱ及N末端糖基化位点相对保守.并首次发现在HCV 2a亚型(283血清)中多个准种序列存在1 279nt(E1区,313aa)处单碱基插入优势基因突变,导致HCV包膜蛋白编码突变与中断(E2区,398aa).本研究对中国HCV代表株包膜蛋白E1/E2编码基因的准种多样性及一种新型插入突变进行了描述,可为进一步研究HCV免疫逃避与慢性化机制提供重要信息.
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嵌合中国河北株包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型的传代分析
建立稳定的嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系,进行传代特性分析.本研究经体外转录获得嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)全长RNA,脂质体法转染Huh7.5-CD81细胞,连续传代培养,进行Real Time RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot、再感染试验与感染滴度检测及序列分析.结果表明:嵌合重组HCV RNA转染Huh7.5-CD81细胞后可产生感染性的病毒颗粒(HCVcc);传代过程中,Western blot可检测细胞内HCV蛋白的表达;IFA检测阳性细胞数逐渐增多,41d升至高峰,达80％～90％;RealTime RT-PCR检测传代细胞上清中HCV RNA拷贝数在104～107拷贝/mL;再感染实验嵌合HCVcc高感染滴度为104 ffu/mL.序列分析显示在传代后期嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变,导致6处氨基酸改变.结论嵌合中国河北株1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养体系可以产生具有感染性的嵌合HCV病毒颗粒,传代后感染性增强并且嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变.
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鸭乙型肝炎病毒基因组结构及其编码蛋白的研究进展
鸭乙型肝炎病毒(DHBV)属于禽嗜肝病毒属、嗜肝DNA病毒科病毒,与人乙型肝炎病毒(HBV)具有相同的复制方式及相似的基因结构、抗原结构.DHBV基因组是闭合环状不完全双链DNA,3个主要ORF-PreS/S、ORF-PreC/C、ORF-P位于负链,编码L蛋白、S蛋白、C蛋白和P蛋白.本文通过对DHBV基因组结构特征及其编码病毒重要蛋白的基本特性、结构特点与功能进行全面阐释,旨在对DHBV的深入研究提供重要参考和以DHBV人工感染建立的动物模型研究HBV提供重要理论依据.
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丙型肝炎病毒入胞抑制剂的研究进展
丙肝感染是全球性的公共卫生问题之一,目前尚无预防丙肝病毒感染的疫苗,联合应用靶向丙肝不同复制阶段的药物,即所谓的“鸡尾酒”疗法可能会有更好的疗效.丙肝病毒进入宿主细胞的过程是药物干预的重要环节,这个过程是由丙肝病毒的包膜蛋白与宿主因子作用介导的,其中病毒的包膜蛋白包括E1、E2,宿主因子包括硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)、膜蛋白CD81、B族Ⅰ型清道夫受体(Scavenger receptor class B type Ⅰ,SR-BI)、两种紧密连接蛋白Occludin(OCLD)和Claudin(CLDN)、低密度脂蛋白受体(Low densitity lipoprotein receptor,LDLR)、树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(Dendritic cell-specific ICAM-3-grab-bing nonintegrin,DC-SIGN)、肝/淋巴细胞特异性细胞间粘附分子3-结合整合素分子(Liver/lymph node specific ICAM-3-grabbing inte-grin,L-SIGN)和转铁蛋白1受体(Transferrin receptor 1,TfR1)等.病毒的包膜蛋白和这些宿主因子都可以作为靶向丙肝入胞抑制剂的作用靶点,许多研究表明丙肝入胞抑制剂作为一种新颖和有发展前景的化合物与作用于复制阶段药物联合应用能够更有效的治疗丙肝.本文综述了自20世纪90年代以来发现的靶点和靶向丙肝病毒进入宿主细胞的化合物.
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不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测
利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,将从一株HIV-1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段,克隆入转移载体中得到重组病毒.用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出3种HIV包膜蛋白,即GP120-41P、GP41T、GP41P,分别含有HIV-1包膜糖蛋白GP120及部分GP41,删除了N端12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约240个氨基酸的GP41.收获后分别以Western-blotting和EIA检测,有较好的免疫学活性,其中GP41T的活性强.该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据,加以改进后可能有免疫检测的价值.
关键词： Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统 人免疫缺陷病毒 包膜蛋白 抗原 表达 -
云南省瑞丽市2016年登革病毒包膜蛋白基因进化特征分析
为阐明云南省德宏州瑞丽市2016年登革病毒(Dengue virus,DENV)流行株包膜蛋白(Envelope protein,E)基因进化特征及其血清型、基因型和流行病学特点.采集登革热患者急性期血清标本,用RT-PCR法检测DENV核酸,用C6/36细胞培养法分离病毒,并进行DENV C/PrM和E基因核苷酸序列测定,用MEGA6.0软件邻接法(Neighbor-Joining)进行E基因系统进化分析.结果从瑞丽市2016年登革热患者血清中分离到25株DENV(本地感染病例15株和缅甸输入性病例10株),并获得这25株病毒的E基因核苷酸序列,系统进化分析表明,14株为DENV血清型1型(DENV-1)的基因Ⅰ型,2株为DENV-2亚洲基因Ⅰ型,5株为DENV 3基因1型,4株为DENV 4基因Ⅰ型.这些新分离株与2013～2015年瑞丽市(11 DENV-1、4 DENV-2和2 DENV-4)和临沧市(2 DENV-1)相同血清型DENV代表株的基因型和进化群相一致,而与西双版纳州2013年DENV-3基因Ⅱ型和2015年DENV-2全球基因型不同.所有瑞丽市DENV流行株均与缅甸等东南亚国家流行株具有较近的亲缘关系.这4种血清型DENV广泛分布于中缅两侧边境地区.本研究证实,2016年我国瑞丽市存在着4种血清型DENV的流行,其中DENV-1、DENV-2和DENV-4与2013～2015年瑞丽市同血清型流行株的基因型及其进化群相同,DENV-3为2016年首次出现本地流行.所有血清型病毒的传播来源均为缅甸北部边境地区,应加强中缅两侧边境地区登革热联防联控工作.
关键词： 登革病毒(DENV) 包膜蛋白 基因 系统进化分析 -
中国HCV3b型包膜蛋白编码基因的克隆分析与假病毒制备
从中国丙型肝炎病毒(HCV) 3b亚型感染者克隆分析包膜蛋白编码基因,并用于HCV 3b亚型假病毒制备.本研究从中国HCV感染血清中筛选克隆到2个3b亚型包膜蛋白编码基因,序列分析后构建表达质粒,以1b(Con1)作为对照,体外转染293T细胞后分析不同包膜蛋白表达水平,并制备了HCV 3b亚型假病毒(HCVpp),比较不同HCVpp感染效率.结果表明:2个3b亚型包膜蛋白编码基因(C27与C30)与国际3b参考株TrKj的进化关系较近.C27与C30核苷酸与氨基酸同源性较高(分别为98.5％与98.2％),包膜蛋白编码区存在10个氨基酸位点差异,且C27包膜蛋白体外表达水平明显高于C30,其中C27可制备出高感染效率的HCV 3b型假病毒,其感染效率明显高于C30与HCV 1型(Con1)制备的HCVpp.本研究分析了2个HCV 3b亚型感染者包膜蛋白编码基因序列及表达特性,并首次获得了高感染效率的HCV 3b亚型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具.
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埃博拉病毒包膜蛋白GP基因DNA疫苗诱导小鼠产生高滴度中和抗体
目的 探讨埃扎伊尔-埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus)包膜蛋白(GP)DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的特性及研制埃博拉病毒DNA疫苗的可行性.方法 构建埃博拉病毒包膜蛋白GP真核表达质粒Peak13CD5LGP,采用100μg剂量的质粒免疫小鼠,以纯化的埃博拉病毒包膜蛋白亚单位融合蛋白(GP1-Fc)作为抗原,通过ELISA检测及Western blot验证测定血清抗体滴度及特异性.结果 100μg质粒免疫小鼠3次后,小鼠血清中GP中和抗体滴度达到1:2 000.结论 编码埃博拉病毒包膜蛋白GP的DNA疫苗(pEAK13CD5LGP)能够诱导小鼠产生高滴度和持久的中和抗体,作为埃博拉病毒疫苗具有潜在的应用价值.
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登革病毒包膜蛋白疫苗的研究进展
登革热由登革病毒引起,有时会发生更严重的登革出血热和登革休克综合征,严重威胁人类的健康.登革病毒疫苗的研究已有50多年的历史,迄今仍无有效的疫苗被批准使用.病情加重的发病机制可能与抗体依赖的增强作用有关,理想的登革疫苗是对四种血清型登革病毒都具有保护作用.包膜蛋白是登革病毒的主要抗原,现以包膜蛋白为目的抗原的登革疫苗的研究作一综述.
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寨卡病毒E蛋白在重组杆状病毒中的表达
目的 在杆状病毒中表达寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)包膜蛋白(Envelope protein,E蛋白).方法 人工合成ZIKV E基因全长序列(1 518 bp),并克隆到pFastBac1载体上,得到重组杆状病毒转移载体pFB1-E,转化含DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-E,转染sf9细胞,得到重组杆状病毒rBac-E.检测病毒滴度,PCR法检测E基因的插入,间接免疫荧光和Western blot法检测E蛋白的表达.结果 经PCR方法鉴定,重组杆状病毒骨架质粒构建成功,重组病毒rBac-E(第3代)病毒滴度为2.58×105pfu/ml.提取感染rBac-E的sf9细胞基因组,经PCR扩增得到3 830 bp的条带,间接免疫荧光检测出现特异性绿色荧光.Western blot鉴定可见感染重组杆状病毒rBac-E的细胞沉淀中在相对分子质量55×103处有特异性条带.结论 在杆状病毒表达系统中重组表达了ZIKV E蛋白,为ZIKV E蛋白功能研究及疫苗的开发奠定了基础.
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同一HCV 1b型感染者来源的准种编码的包膜蛋白制备假病毒的感染效率研究
目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)1b亚型包膜蛋白编码基因,用于HCV 1b亚型假病毒制备与应用.方法 从中国同一1b型HCV感染者(366)体内不同HCV准种中筛选不同的包膜蛋白编码基因,构建表达质粒并制备HCV假病毒(HCVpp),体外感染靶细胞,与前期制备的HCV 1b参考株HCVpp平行比较感染效率,并将HCVpp应用于中和抗体检测.结果 从中国同一1b型HCV感染者(366)体内筛选获得的包膜蛋白编码基因可制备感染效率明显不同(分高/中/低3种类型)的HCVpp,确定了其中一个HCV包膜蛋白基因(366-C)可制备出高感染效率的HCV 1b型假病毒,并应用于HCV特异性中和抗体检测.进一步研究表明366患者不同准种来源包膜蛋白表达水平相近,但序列分析发现感染效率不同的包膜蛋白存在个别氨基酸差异.结论 本研究获得了高感染效率的HCV 1b型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具.
关键词： 丙型肝炎病毒1b亚型 包膜蛋白 假病毒颗粒 感染效率 -
1型登革病毒包膜蛋白功能区在293 T细胞中的表达与鉴定
目的：在293T细胞中获得可溶性表达的1型登革病毒（DENV1）包膜（E）蛋白。方法PCR扩增DENV1-E蛋白功能区（1～394 aa）基因并克隆到Psectag2B-Fc真核表达载体中构建表达质粒，脂质体法转染293T细胞，经2 mg／ml Zeocin筛选，免疫荧光法鉴定所获细胞克隆；Protein-G亲和层析纯化DENV1-E-Fc重组融合蛋白，间接免疫荧光和蛋白免疫印迹法鉴定蛋白的完整性和抗原性。结果获得稳定可溶性表达重组融合蛋白的细胞克隆，蛋白产量约为25μg／1×107个细胞，纯化得到的DENV1-E-Fc蛋白相对分子质量约90×103，该蛋白可与识别天然构象E蛋白的单克隆抗体结合，并与免疫动物血清有良好的反应性。结论在真核细胞中成功获得可溶性表达的DENV1-E-Fc重组融合蛋白，E蛋白功能区保持完整且具备天然的构象表位和良好的抗原性，为包膜蛋白的保护性抗原表位和功能研究奠定了基础。
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乙脑病毒包膜蛋白可溶性表达及纯化
目的：通过原核表达载体对乙脑病毒包膜蛋白进行可溶性表达和纯化。方法筛选不同的表达载体、宿主菌株、表达条件，以获得可溶性的目的蛋白表达。采用镍柱和凝胶过滤层析对表达蛋白进行纯化。结果对不同的载体、菌株、表达条件筛选后，终发现PBCX载体与乙脑病毒包膜蛋白E406基因连接后的质粒，在低温诱导后获得可溶性E蛋白表达，且表达量较高。表达量占可溶性蛋白总量的23％。通过镍柱和凝胶过滤层析纯化后，目的蛋白纯度较高，达85％，满足试验需求。结论本研究获得了可溶性表达的乙脑病毒E蛋白，方法简单高效，为深入研究该蛋白生物学特性和功能，解析乙脑病毒的致病机制、乙脑减毒活疫苗毒株的减毒机制及其质量控制，乙脑诊断试剂开发，奠定了技术基础。
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利用MS2噬菌体包膜蛋白与RNA的特异性相互作用构建临床检测用病毒样颗粒
MS2噬菌体是单链正链RNA病毒,为26 nm长的20面体,共有3 569个核苷酸,包含有3个基因,编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子.噬菌体由180个包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成.在MS2噬菌体包膜蛋白的研究中发现包膜蛋白与噬菌体复制酶5'端由19个碱基(19 mer)组成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用,这种作用可引发噬菌体外壳的组装,同时,将噬菌体基因组RNA包装到包膜内.国外研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装[1-3].本研究拟利用MS2包膜蛋白与RNA的相互作用来观察RNA序列对包装的影响以及基于两者相互作用构建病毒样颗粒在临床分子检测中的应用.
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对陈华根读者来信的回复
编辑同志:陈华根同志的读者来信已收悉,现答复如下:HBsAg是乙肝病毒S基因表达的一种包膜蛋白,尽管其本身没有传染性,但由于是HBV感染后先出现在血清中的病毒抗原,在慢性乙型肝炎患者血液中长期存在.现认为血液中HBsAg的水平与肝脏中HBV复制模板--cccDNA水平有良好的相关性~([1]),因此对HBsAg的检测具有非常重要的临床意义.
