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A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定
目的从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2151中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础.方法经过连续三轮固相"亲和-洗脱-富集"筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS-PAGE和Western-blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物.采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析.结果从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3.其A450分别达到0.469、0.582和0.507.A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4096倍,ELISA结果仍为阳性.结论利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体.
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人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定
目的构建人天然Fab段噬菌体抗体库,建立人源抗体制备技术平台,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法.方法从一个健康献血员取200ml新鲜血液,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA,依次将PCR产物插入载体pComb3相应位点,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13产生噬菌体抗体库,酶切和PCR鉴定有无插入片段,用白蛋白和IL2作为抗原进行筛选富集.结果部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab表达库容达约1.2×106,酶切和PCR显示有插入片段.用不同蛋白进行几轮筛选,抗体库得到了不同程度的富集.结论本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体,用于免疫治疗打下基础.
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噬菌体抗体库技术的发展及未来
噬菌体表面展示技术是近年发展起来的,将外源蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面融合表达的新技术.应用PCR技术从生物体内扩增出整套抗体轻、重链可变区基因,克隆到λ噬菌体表达系统,构建噬菌体抗体库,通过抗原亲和吸附-洗脱-增殖,从中筛选富集多种目的克隆,制备相应单克隆抗体.
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人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒-Gn蛋白重组抗体的研究
为研制人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)Gn蛋白重组抗体,本研究利用噬菌体表面展示技术,以SFTSV全病毒颗粒和重组表达SFTSV-Gn蛋白为抗原,从人源抗SFTSV Fab噬菌体抗体库中筛选抗SFTSV-Gn蛋白的重组Fab抗体,通过ELISA对Fab抗体的结合特异性进行检测.将Fab抗体基因克隆入哺乳动物细胞表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞获得分泌表达的IgG抗体.通过ELISA、IFA和Western-blotting检测IgG抗体的结合特异性.采用亲和层析纯化IgG抗体,并用微量中和试验检测IgG抗体的中和活性.结果表明经过三轮富集筛选,以SFTSV病毒颗粒为抗原筛选出364株针对SFTS病毒核蛋白Fab抗体,没有筛选出特异性结合Gn蛋白的阳性克隆,而通过Gn蛋白筛选得到8株特异结合Gn蛋白的Fab抗体,其中5株来自Lambda库,3株来自Kappa库.ELISA、IFA和Western-blotting检测证实这8株IgG抗体均能特异性结合Gn蛋白.微量中和试验显示8株新筛抗体没有中和活性,但仍可为后续SFTSV人源单克隆抗体的研究提供借鉴和参考.
关键词： 噬菌体抗体库 重组抗体 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒 -
利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体
以细胞法从HIV-1 CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体.将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2_NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性.四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920).这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位.我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1 CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24 μg/mL、0.89 μg/mL和3.09μg/mL.其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69 μg/mL 和3.52 μg/mL.提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体.因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台.
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亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选
本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法.将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG1,进行下一轮筛选.整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用.将此方法应用于HEV NE2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争ELISA,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,终获得2个特异性人源抗体.
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利用重组系统构建大容量噬菌体抗体库
噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的重要方法,此文探讨大容量天然噬菌体抗体库在筛选人源抗体中的实际应用价值.从正常人外周血分离淋巴细胞,通过基因工程方法获得抗体基因并且构建到含有重组位点的载体pDF中获得初级噬菌体抗体库,初级库在重组系统中重组之后获得了容量为9×1010的天然Fab噬菌体抗体库,通过序列测定和重组蛋白筛选来对抗体库的质量进行初步鉴定.对随机挑取的96个克隆测序序列分析表明各种型别比例基本合适;用四种抗原筛选有明显的富集,并且获得了针对其中一种抗原的阳性抗体克隆.
关键词： 噬菌体抗体库 Cre-Loxp重组 Fab抗体 -
噬菌体抗体库技术的构建及应用研究进展
噬菌体抗体库(phage antibody library)技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术.噬菌体抗体库技术的基础,噬菌体展示技术,发展自上世纪80年代中期.1985年,美国密苏里大学的Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段加以改造.Smith将EcoRⅠ内切酶的部分基因片段与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,同时表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.随后,Parmley等[2]将已知抗原决定簇与pⅢ的N端融合呈现在表面,可被抗体特异性选择,从而提出了通过构建随机肽库以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.
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人源抗甲型肝炎病毒Fab在大肠杆菌中的表达及复性
目前已有用于接触前预防的甲肝疫苗,但对于接触后预防,则多采用特异性免疫球蛋白作被动免疫.血源性免疫球蛋白虽应用效果好,但可能被血源中难以检测的病原体污染;鼠源抗体易引起人抗鼠抗体反应.因此基因工程人源抗体有望成为接触后预防的首选制剂.本文在从噬菌体抗体库筛选的抗甲型肝炎病毒(HAV)人源抗体的基础上,选用大肠杆菌高效表达该抗体Fab,并对表达产物进行了复性.
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噬菌体抗体库中筛选血小板膜糖蛋白Ⅱ b/Ⅲa特异的人源性Fab抗体
本研究利用特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患者产生抗血小板自身抗体的特点,从ITP患者脾脏细胞中提取RNA,扩增抗体轻链和重链Fd基因,插入噬粒载体pComb3H,构建人源性抗GP Ⅱ b/ⅢaFab噬菌体抗体库.以表达GP Ⅱ b/Ⅲa的CHO123细胞筛选抗体库,制备人源性GPⅡb/Ⅲa Fab噬菌体抗体.
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大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定
目的构建大容量噬菌体单链抗体库,从中筛选人源单链抗体(ScFv). 方法从正常成人外周血和新生儿脐血分离淋巴细胞,用RT-PCR扩增轻链可变区基因(VL)和重链可变区基因(VH),通过重叠PCR法将VH和VL拼接形成ScFv基因,并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到ScFv初级噬菌体抗体库.以高MOI超感染cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链的组合配对,得到大容量抗体库,用多种抗原对抗体库进行生物淘筛,鉴定抗体库的性能. 结果获得了6×1010的大容量单链噬菌体抗体库.分别用卵清蛋白、胃蛋白酶、铁蛋白、人角蛋白、人TNF-α、地高辛等6种抗原进行筛选,均得到多样性的特异性噬菌体抗体. 结论经loxp-cre定位重组系统在单细胞内重组成功地构建了大容量单链噬菌体抗体库,初步尝试对6种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库可用于制备具有应用前景的人源抗体.
关键词： 噬菌体抗体库 Loxp-cre重组系统 单链抗体 -
人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达
目的 构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体.方法 从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库.用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测.结果 抗体库库容为5.2×106,Fab基因重组率为30%.ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体.DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因.结论 成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定
本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发,用基因克隆技术将B细胞全套κ轻链和重链Fd片段基因克隆出来,组装到表达载体pComb3H-SS内并表达到噬菌体表面,构建出Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库筛选后,获得针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系膜抗原的抗体.
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从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究
目的从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体. 方法 ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定,竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体,中和试验进一步确定中和活性,进而对其序列进行测定和分析. 结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体,竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合,中和试验确定其具有一定中和活性,编号为M1A和P8A,测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆. 结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性,它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础.
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链替换技术提高抗角蛋白人Fab抗体的亲和力
目的通过链替换技术对一株人源性抗角蛋白Fab单抗进行体外亲和力成熟。方法分离、扩增多样性人免疫球蛋白轻链基因和IgG/IgM重链Fd段基因，分别构建轻链库和重链库。先以原始克隆的重链与轻链库随机搭配进行轻链替换，对形成的换链库采用解离速率筛选法（off-rate selection）选取亲和力提高的克隆；然后再将获得的轻链基因与重链库基因重组进行重链替换，筛选亲和力进一步提高的克隆并进行亲和力测定、可变区基因序列分析等一系列鉴定。结果替换轻链后所获抗体的亲和力提高到原来的10倍；替换重链后亲和力进一步提高达到7.9×1010/mol/L，是原始克隆的近23倍。结论链替换技术是提高抗体库中所获Fab抗体亲和力的有效手段。
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用CDR3导向抗体库法对鼠抗人膀胱癌单抗进行人源化
目的构建含鼠单抗CDR3的人源噬菌体抗体库,对膀胱癌鼠单抗进行人源化. 方法通过重叠PCR及DNA重组技术,将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和Vκ组合,构建含BDI CDR3的人源噬菌体抗体库;利用loxp-cre定位重组系统,增加轻、重链的组合配对,获大容量抗体库;用膀胱癌细胞(EJ)从中筛选人源化抗膀胱癌单抗Fab段,ELISA方法对所筛克隆进行特异性鉴定,同时运用竞争抑制实验对所筛特异性克隆进行抗原表位的核实. 结果首先构建了库容为2×107的含鼠CDR3区的人源噬菌体抗体库;经过在cre+细菌胞内的定位重组后,获得库容为1010的大容量噬菌体抗体库;用EJ细胞筛选到可与其特异结合的人源性Fab段;竞争抑制实验表明所获人源抗体片段与亲本鼠源单抗结合同一抗原表位. 结论在没有亲本鼠单抗基因,仅了解其CDR3序列的条件下,可通过CDR3导向,构建大容量抗体库,筛选到相应的人源化抗体基因.
关键词： 噬菌体抗体库 鼠单抗人源化 Loxp-cre重组系统 膀胱癌 -
全人源肝癌噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选
目的:对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性进行鉴定.方法:PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率.先以人成纤维细胞黏附后再以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮"黏附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.结果:ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍.筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定后,均可检测到目的基因.得到3株特异性肝癌单链抗体.结论:利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.
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抗胃癌抗体轻链可变区序列测定和三维结构模建
目的:确定抗胃癌抗体轻链可变区(VL)的一级结构,并模建其三级结构.方法:从抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出VL基因,并进行序列测定和分析.利用同源蛋白结构模建技术,采用计算机辅助分子设计系统模建VL的三维空间结构.结果:所获得的VL序列符合鼠抗体可变区特征,并成功构建了其三维空间结构.结论:所测得的VL一级结构和构建的三维空间结构均有较高的可靠性.
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抗地高辛人源小分子抗体的获取
目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体,并构建双体抗体.方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性,对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的克隆进行改造,构建双体抗体.结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因,阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第一亚群,重链分别属于第三和第四亚群.选取4号克隆进行基因改造,构建双体抗体表达载体,获得了活性较好的双体抗体.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的双体抗体,可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体.
