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一种小分子生物活性肽(重组BMP)的质谱分析
目的 对一种小分子生物活性肽(重组BMP)样品进行电喷雾质谱测定,初步确定其一级结构.方法 离子化方式:电喷雾离子化;检测方式正离子;质量扫描范围m/z 150~1 000;干燥气(N2)流速5 arb;雾化气(N2)压力35 arb;毛细管出口电压4.5 kV;碎裂器电压100V;碰撞诱导解离技术碎裂器电压为35%;碰撞气流量为电子流量控制器自动控制;进样方式:流动注射进样;流动相为乙腈:水(50:50).结果 利用电喷雾质谱技术,初步测定重组BMP样品的一级结构为H-Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Pro-OH.结论 该方法能够初步测定小分子生物活性肤的一级结构,为实验室生物工程菌构建提供准确有效的检测技术.
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昆虫PBAN家族神经肽研究进展
昆虫神经肽在昆虫生长发育过程中有着重要的生理功能,胚胎发育、蜕皮变态、滞育、迁飞、代谢、生殖等都离不开神经肽的调控.近20年来,随着生物化学和分子生物学技术的发展与应用,一系列重要的昆虫神经肽被分离、纯化,氨基酸一级结构被确定.至今总共发现了100多种昆虫神经肽,这些肽根据功能或结构序列的相似性大约分为20组(或家族),其中PBAN/pyrokinin是近年才出现的一个神经肽家族,是C端具有五肽FXPRL(X=S,V,T,G等)(苯丙-X-脯-精-亮氨酸)序列的一类神经肽.
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HFRS患者BLCL的建立及HTNV S基因片段在其内获得长期稳定的表达
虽然对汉坦病毒核蛋白(HV NP)氨基端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性已进行了许多研究,并已用于出血热的诊断,但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未完全明确.而研究T细胞表位的前提是首先要构造含病原体抗原基因片段的表达载体质粒.要实现CTL效应细胞对靶细胞的有效杀伤,前提条件之一是效靶细胞必须具有相同的HLA型别.通常选用与效应细胞同源即同一供者的PBMC建立靶细胞,本研究采用与HV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)建立靶细胞系,将含有不同汉滩病毒(HTNV)S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.
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尼曼-匹克病一例
尼曼-匹克病(niemann-pick disease ,NPD)又称鞘磷脂沉积病(Sphingomyelin Lipidosis)是具有高度表型异质性的疾病,为常染色体隐性遗传[1].NPD的酶缺陷可能是神经鞘磷脂酶的遗传密码改变,突变基因使合成了结构异常的肽链一级结构[2].我院诊断了首例NPD.
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DNA高甲基化与抑癌基因
哺乳动物基因组中,DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化.DNA甲基化是一种基因外修饰,不改变DNA的一级结构;他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用.全基因组低甲基化,维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象.DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.本文综述了抑癌基因的高甲基化、DNA修复基因的高甲基化、甲基化与转录的关系以及导致转录失活可能存在的作用机制、寻找甲基化相关基因的依据原则、甲基化的检测方法、肿瘤甲基化图谱的特征、甲基化与突变的相互作用、导致甲基化产生的原因、及其广泛的应用前景.
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大鼠肝再生相关基因LRRP1的人同源基因是一种新型琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因
目的:应用分子生物学和生物信息学方法,寻找、克隆大鼠肝再生相关基因LRRPl的人的同源基因,阐明LRRPl基因的结构和功能,为研究肝脏再生调节的分子生物学机制奠定基础.方法:利用美国国立卫生研究院建立的核苷酸数据库(GenBank)以及相应的核苷酸序列同源性搜索分析软件(BLASTN),以大鼠的LRRPl的cDNA序列作为参照,对于人的同源性cDNA序列进行搜索分析,寻找人的LRRPl的同源基因序列.利用蛋白质一级结构序列的数据库以及相应的同源蛋白序列的搜索分析,阐明人LRRPl蛋白质一级结构与已知蛋白序列的同源性,从而根据蛋白质一级结构的相似性,对于新克隆基因进行功能方面的预测分析.应用在线软件的分析,对于人LRRPl蛋白质一级结构序列进行分析预测,分析其氨基末端序列是否具有信号肽序列,以判断人LRRPl蛋白是否是一种可以分泌表达的蛋白;同样对人LRRPl蛋白质一级结构序列进行在线软件的分析,对于人LRRPl蛋白质分子结构中的潜在的糖基化位点以及其他类型的修饰位点进行预测.结果:人的LRRPl的编码基因由480nt组成,编码产物由159aa组成.人LRRPl的蛋白质一级结构序列与人琥珀酸脱氢酶亚单位D、牛琥珀酸脱氢酶亚单位D高度同源,同源性分别为79%(126/159),78%(123/156).人LRRPl是一种分泌蛋白,在其分子结构中具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和豆蔻脂化修饰位点.结论:人LRRPl蛋白是一种新型的琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因.
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HBV核心蛋白结合蛋白1编码基因C1的克隆化
目的:对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白l的基因C1进行克隆化研究.方法:对应用酵母双杂交技术筛选的白细胞中与HBV核心蛋白结合的新蛋白基因,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因的编码序列,根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为C1,在GenBank中注册,注册号为AY555145.结果:C1基因编码区为366个核苷酸(nt),编码产物由121个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,表明我们克隆的C1基因属于未知功能新基因.结论:成功克隆了HBV核心蛋白结合蛋白新基因C1.
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乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化
目的:研究乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化.方法:构建前-前-S的酵母细胞表达载体,采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.发现其中有1个未知功能的新基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为PPSBP9并在GenBank中注册,注册号为AY553877.结果:PPSBP9基因的编码序列全长为840个核苷酸(nt),编码产物由279个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性.结论筛选并成功的克隆了乙型肝炎病毒前-前-S蛋白与肝细胞cDNA文库中结合蛋白新基因PPSBP9,为进一步研究HBV前-前-S及其肝细胞结合蛋白新基因在HBV致病中的作用奠定了基础.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对MDM4信号转导的影响
0 引言Shvarts et al[1]报告了一种与p53蛋白结合蛋白的新基因,命名为MDMX,与MDM2蛋白在一级结构上具有同源性,特别是在p53蛋白结合域更是如此.另外,MDM2羧基末端的金属结合域在MDMX分子中也是高度保守的.MDMX蛋白又称为MDM4,是p53的一种结合蛋白,是p53蛋白的负调节因子.
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HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化
目的:利用生物信息学(bioinformatics)技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白(PSlBP)编码基因的同源基因.方法:人PSlBP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PSlBP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)生物工程信息学研究中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PSlBP的cDNA序列之后,对于大鼠PSlBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PSlBP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PSlBP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析.结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PSlBP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PSlBP的cDNA其编码产物的序列.大鼠PSlBP的cDNA由1 455 nt组成,编码产物由484aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%(391/484)和92.98%(450/484).利用在线分析软件,在大鼠PSlBP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点.结论:大鼠PSlBP基因及其编码产物序列被确定.
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乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析
目的:从中国慢性乙型肝炎患者的血清中,应用长距离多聚酶链反应技术(L-PCR)技术扩增、克隆乙型肝炎病毒(HBV)的全基因组序列,建立中国HBV流行株的参考标准序列.方法:从2例慢性乙型病毒性肝炎患者血清提取DNA,以L-PCR技术对于3 200 bp的HBV DNA进行扩增,纯化后克隆到TA载体中进行序列分析.对于HBV DNA的各个编码基因区进行分析.结果:克隆获得的5个HBV DNA全基因序列分别为G376-A6、G376-A7、G683-A1、G683-A2和G683-A3,全基因序列长度分别为3 125、3 215、3 213、3 182和3 215碱基对(bp),在GenBank中的注册号分别为AF384372、AF384371、AF363963、AF363962和AF363961.其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者,G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者.G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区.其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变.来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别,但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性.G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变,但不在多聚酶蛋白的活性结构区,因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性.G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区,使其多聚酶区结构被破坏.5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守.但是相对来讲,X蛋白的氨基末端更为保守,羧基末端序列有一定程度的变异.结论:克隆了HBV DNA中国株的全基因序列,可以作为研究中HBV流行株的参考序列.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析
目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析.获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列.对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息.同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列.通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点.通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成.人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构.通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上.在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点.利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列.对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能.利用在线软件,对人的HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息.这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景.
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抗胃癌抗体轻链可变区序列测定和三维结构模建
目的:确定抗胃癌抗体轻链可变区(VL)的一级结构,并模建其三级结构.方法:从抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出VL基因,并进行序列测定和分析.利用同源蛋白结构模建技术,采用计算机辅助分子设计系统模建VL的三维空间结构.结果:所获得的VL序列符合鼠抗体可变区特征,并成功构建了其三维空间结构.结论:所测得的VL一级结构和构建的三维空间结构均有较高的可靠性.
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血清新型冠状病毒特异性抗体水平的检测及其动态变化规律
重症急性呼吸综合征(SARS)的病原体相继被不同实验室发现并确证为一种新型冠状病毒,又称为SARS病毒[1],已确定了病毒基因的一级结构和一些基因组特征,为利用分子免疫学手段研究和建立SARS的血清学诊断方法奠定了基础[2].我国军事医学科学院等单位已成功建立了检测SARS病毒抗体的ELISA方法,并开发出相应的检测试剂盒.本研究采用ELISA方法检测SARS患者和医务人员血清SARS病毒特异IgG抗体,观察SARS病毒抗体在患者和高危易感人群的产生规律和水平,为SARS的诊断及其流行传播特点的分析提供实验依据.
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生长抑素一级结构的电喷雾质谱分析
目的生长抑素的分子量及其一级结构的测定.方法应用电喷雾质谱法(ESI-MS)测定了环肽药物生长抑素的分子量,用2-巯基乙醇将生长抑素的双硫键还原,再用源内碰撞诱导解离技术进行测定,根据其典型碎片离子确证其氨基酸序列.结果测得生长抑素准分子离子峰[M+H]+ m/z 1 637.8, [M+Na]+ m/z 1 659.5及[M+2Na-H]+ m/z 1 681.5,[M+2H]2+ m/z 819.5及[M+H+Na]2+ m/z 830.3,表明生长抑素的分子量为1 636.7,与理论值一致.将双硫键还原后,用CID技术进行测定,得到了一系列y和b系列的特征碎片离子,证实生长抑素还原产物的氨基酸序列为A-G-C-K-N-F-F-W-K-T-F-T-S-C.结论用ESI-MS法测得的生长抑素的分子量及一级结构与理论值相符.
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一种槲寄生多肽的一级结构分析和抗肿瘤活性
目的研究槲寄生枝叶中肽类抗肿瘤活性成分并阐明其结构.方法应用阳离子交换、凝胶过滤及高效液相等色谱方法进行分离纯化,基质辅助激光解吸飞行时间质谱用于测定质量数.采用Edman降解结合酶解法确定多肽的完整序列.对多肽用MTT法进行体外抗肿瘤活性评价.结果从槲寄生中纯化出一种新的多肽,命名为槲寄生毒素B2(viscotoxin B2),其一级结构为KSCCKNTTGRNIYNTCRFAGGSRERCAKLSGCKIISASTCPSDYPK.Viscotoxin B2对体外培养的大鼠成骨样肉瘤细胞的IC50为1.6 mg·L-1.结论Viscotoxin B2与白果槲寄生中的槲寄生毒素有很高的同源性,并具有较强的抗肿瘤活性.
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液质联用分析rhTNK-tPA的一级结构
液质联用分析重组人组织型纤溶酶原激活物变构体(TNK-tPA)的一级结构.用糖苷酶切除其糖基,测定质谱分子量;对其进行还原、烷基化、胰蛋白酶酶解,测定液质肽图及串联质谱图,通过质谱图的解析对氨基酸序列进行验证,并对翻译后修饰进行鉴定.该蛋白氨基酸序列与理论一致,其中约5%的M207发生氧化;约80%的T61发生岩藻糖化修饰;N103、N448、N184(约15%)存在N-糖基化修饰,糖型均为复杂型N-糖.液质联用结合适当的样品前处理方式,可快速、准确地对该蛋白的一级结构进行鉴定.
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我国已上市重组人促红细胞生成素的一级结构比较
目的 对我国已上市的重组人促红细胞生成素的一级结构进行比对分析.方法 针对9家制药企业生产的重组人促红细胞生成素理化对照品,测定质谱相对分子质量、液质肽图、寡糖图谱及唾液酸含量,并对测定结果进行比对分析.结果 各样品去除N-糖基后实测相对分子质量均与理论值一致,误差均小于1;液质肽图测定中氨基酸覆盖率均为100%,序列均与理论一致;二硫键连接方式均为Cys7-Cys1 61、Cys29-Cys33;O-糖基化位点均为Ser 126,N-糖基化位点均为Ash24、Asn38、Asn83;各样品的糖基修饰方式存在差异,不同糖型的相对比例不一致;唾液酸含量测定结果介于(物质的量的比11.5~15.7)促红细胞生成素之间.结论 9家EPO制品的一级结构基本一致,差异主要表现在糖基修饰水平.
关键词: 一级结构 重组人促红细胞生成素 糖基化 二硫键 -
开发生产手性药物的重要意义
生命化学是在高度不对称的环境中进行的,酶是生命的催化剂;蛋白质是生命的存在方式,它们都是L-氨基酸通过肽键构成大小不等的长链状一级结构,进而折叠、旋转成不对称的高级结构.
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红细胞生成刺激素对各类贫血的临床应用
1906年Carnot首先发现了红细胞生成素(EPO).1977年Mitake从再生障碍性贫血患者尿液中分离出EPO并将其纯化搞清了EPO的一级结构,1983年Lin等分离并克隆了人类EPO的基因,随后,红细胞生成素受体(EPO-R)的基因也被成功克隆.随着分子生物学理论及技术的飞跃发展,体外已大量生产出重组人类红细胞生成刺激素(rHuEPO)并于1986年应用于临床.