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结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究
目的 构建Mtb ESAT6-RpfE(早期分泌抗原靶6-复活促进因子E)的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究.方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白.采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6-RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺(dimethyl-dioctyldecyl ammonium bromide,DDA);第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG[DDA+ poly(I:C)+明胶].分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠.末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平;ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1.结果 PCR扩增的esat6、rp/E基因序列与GenBank报道一致;融合蛋白主要以包涵体形式表达;亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(427.13±100.46)]显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P<0.001);分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(506.50±140.40)]明显高于PBS组(19.25±14.75;q=11.36,P<0.001)和BCG组(125.5±46.41;q=8.882,P<0.001).FSAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体.结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白.此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究.
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结核亚单位疫苗AEC/BC-C02诱导小鼠长期的抗原特异性细胞应答
目的 动态评价结核亚单位候选疫苗AEC/BC-C02在小鼠中的细胞免疫应答水平.方法 6~8周龄SPF级BALB/c雌鼠48只,按数字表法随机分成两组,一组免疫AEC/BC-C02,另一组免疫PBS.末次免疫后第1、2、4、8周分别取两组小鼠(6只/组)分离脾淋巴细胞,ELISPOT检测分泌抗原特异性IFN-γ的T细胞频率;在第2、4、8周ELISA检测抗原特异性IFN-γ的分泌量;在第4、8周,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测脾淋巴细胞增殖.结果 (1)末次免疫后第1、2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B特异性的IFN-γ斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)分别为168.8±103.5、205.2±51.0、206.8±65.3和160.0±67.9,与PBS对照组的8.9±6.0、16.1±18.8、9.3±4.9和7.7±6.6比较,差异均有统计学意义(成组t检验,t值分别为3.779、8.525、7.424、5.473;P值均<0.01);EC特异性的IFN-γ SFC分别为45.1±18.6、75.6±39.3、86.2±50.4和54.3±26.3,与PBS对照组的4.5±3.5、11.7±10.5、3.8±5.8和5.2±4.3比较,差异均有统计学意义(成组t检验,t值分别为5.258、3.850、3.977、4.521;P值均<0.01).(2)末次免疫后第2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(1.27±0.13) ng/ml,(1.76±0.55) ng/ml和(1.44±0.44) ng/ml;EC多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(0.81±0.33) ng/ml,(0.81±0.69) ng/ml和(0.54±0.29) ng/ml,两者间差异有统计学意义(配对t检验,分别为:t=3.008,P<0.05;t=2.631,P<0.05;t=10.02,P<0.01).(3)末次免疫后第4、8周,Ag85B多肽对疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数(SI)分别为1.756±0.339和1.936±0.287,均分别高于PBS组的1.287±0.0581和1.382±0.114,差异有统计学意义(成组t检验,分别为:t=3.030,P<0.05;t=4.387,P<0.01);EC多肽对疫苗组SI分别为1.599±0.154和1.581±0.156,均分别高于PBS组的1.380±0.126和1.314±0.170,差异有统计学意义(成组f检验,t值分别为2.540、2.844;P值均<0.05).结论 新型结核亚单位疫苗AEC/BC-C02免疫小鼠可诱导长期稳定存在的抗原特异性记忆T细胞,为后期抗Mtb保护力研究提供药理学基础.
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结核分枝杆菌Ag85复合物相关疫苗研究进展
目前全球TB疫情呈上升趋势,而惟一使用的结核病疫苗-BCG的保护效力大不如前,因此新型结核病疫苗的开发迫在眉睫.利用Ag85复合物在Mtb感染中具有明显保护性效应为基础而研制的疫苗受到广泛关注.笔者对Ag85复合物相关亚单位疫苗、重组BCG和基因疫苗研究取得的成果进行综述,结果表明少数Ag85复合物相关疫苗的保护作用超过BCG,某些新疫苗作为初种疫苗给予新生儿、儿童和青少年接种是安全、有效的;作为增强剂给予成人接种,可以提高机体免疫力;某些疫苗与化疗药物联合可以提高机体的免疫力,提高化疗效果,但能否取代BCG尚需大规模临床实验证实.
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药物流产终止生化妊娠112例临床效果分析
生化妊娠即血清入绒毛膜性腺激素p亚单位(β-hCG )高于正常水平,但B超检查还无法检测出宫腔内、外孕囊的妊娠阶段.米非司酮终止早期妊娠已在临床普遍应用,而且形成了比较规范的应用指南,但需要明确诊断出宫内孕囊后再予药物治疗,在等待过程中给非意愿妊娠妇女带来了心理压力,同时多次复查随访也增加了她们的经济负担和时间消耗.
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KATP通道开放剂在缺氧缺血性脑损伤中的特性研究
Noma在心肌细胞上发现三磷酸腺苷敏感性钾通道(KATP通道)已经有300多年,此通道由4个内向整流钾通道(Kit6.1或Kir6.2)亚单位和4个调节性磺脲类受体(SURI,SUR2A或SUR2B)组成的八聚体.
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检测肠产毒性大肠埃希菌GM1-ELISA方法的建立
肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)是重要的致病因子不耐热肠毒素(LT),由一个具有5-腺苷二磷酸二钠盐(ADP)糖基化活性的A亚单位(LTA)和神经结苷脂(GM1)有特异性高亲和力的B亚单位(LTB)构成.
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整合素αVβ3与病毒感染
整合素αvβ3是一类表达于细胞表面的跨膜糖蛋白粘附分子,由α和β两种Ⅰ型膜蛋白亚单位以非共价键形式连接形成异源二聚体分子.
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酶联免疫吸附法测定三种CTB与其受体GM1的亲和性
霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌产生的相对分子质量为84 kD的肠毒素,由1个A亚单位(CTA)和5个B亚单位(CTB)形成的五聚体共价连接而成.CTA(大约28 kD)为毒性亚单位,CTB(大约12 kD)为无毒的受体结合亚单位,可以和所有有核细胞膜上的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)结合.CTA则通过CTB与GM1的结合作用得以进入细胞发挥其毒性级联反应[1,2].目前,CTB已作为载体蛋白广泛用于基础研究.本文采用ELISA法测定了两种国产CTB与其受体GM1之间的亲和性,并与国际标准品CTB进行了比较.
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在发育过程中小鼠脑N-甲基-D-门冬氨酸受体亚单位蛋白的表达
为了测定新生小鼠发育过程中脑组织中NMDA受体亚单位蛋白的表达水平,用NMDA受体亚单位特异的抗体,通过引入成年小鼠皮层组织系列稀释的样品作标准,建立了定量的免疫印迹分析法.并对出生后不同日龄(2~35d)新生小鼠前脑和小脑组织中NMDA受体ζ1、ε1和ε2亚单位蛋白进行了测定.结果表明,ζ1、ε1和ε2三个亚单位在大鼠前脑组织中呈相似的增加趋势,只是ε1的表达明显的滞后.而小脑此3种亚单位的表达绝对量均明显低于前脑组织,并且趋势各不相同:ζ1经明显的下降后维持在一定的水平,ε1呈增加趋势,ε2出生后5d即有相当的表达,以后下降,3周后几乎不能测出.上述结果与相应的mRNA半定量分析结果基本一致,并且与大鼠同类研究结果大致吻合.
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G蛋白βγ亚单位介导的信号转导途径
跨膜信息传递有关的G蛋白由α、β和γ亚单位所组成,受体激动后,引起GTP与α亚单位结合,导致Gα与Gβγ分离.近年来发现Gα、受体本身和许多效应分子如K+通道、Ca2+通道、磷脂酶C-β、腺苷酸环化酶、酪氨酸、 MAPK和受体激酶等都受Gβγ的调节,Gβγ同Gα一样均可引起效应蛋白的激活,在细胞信号转导中起同样重要作用,共同介导一系列的生物学效应.
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PCV2-ORF2去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价
目的 通过基因工程的方法表达猪圆环病毒2型的ORF2蛋白,并对表达蛋白进行小鼠免疫效力评价,为猪圆环病毒病疫苗的研制提供技术支持.方法 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物.从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的死亡仔猪病料中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出ORF2去信号肽基因,将该基因克隆至原核表达载体pET32α,获得重组质粒,经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为目的基因,插入的位置、大小和阅读框均正确,成功构建了重组质粒pet32α-ORF2,阳性重组质粒转化大肠杆菌Blgold(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达的佳条件,表达产物经纯化后,以每只小鼠0.2mg免疫5周龄的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况.结果 纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7d开始产生抗体,第28d抗体水平达到高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性.结论 表达目的蛋白能在小鼠体内产生特异性抗体,为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础.
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乳腺癌中蛋白激酶AI型α调节亚单位mRNA的表达及其临床意义
我们利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,对49例乳腺癌组织进行了蛋白激酶A的Ⅰ型α调节亚单位(PKAR Ⅰα)mRNA水平的检测并研究其与临床病理的关系.
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EV71病毒疫苗研究进展
肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)为二十面立体对称的球型结构,直径为24-30 nm.病毒衣壳由60个亚单位构成,每个亚单位由4种衣壳蛋白(VP1-VP4)组成[1].根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异,可将EV71分为A、B、C 3个基因群和11个基因类型(A,B1-B5和C1-C5)[2].EV71引起的手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)和疱疹性咽峡炎,在世界各地均有暴发流行,是一种在儿童中常见的自限性疾病.
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位重组蛋白纯化及免疫活性研究
热休克蛋白(heat shook protein,Hsp)为幽门螺杆菌(Hp)共同的抗原成分,分为A(HspA)、B(HspB)两个亚单位.目前,通过细菌培养获得大量Hp,并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难.因此,我们采用基因工程技术构建重组HspA基因工程菌,并对HspA重组蛋白纯化条件及免疫学活性进行研究.
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免疫佐剂联合中药治疗Hp感染BALB/c小鼠免疫状态的研究
本文研究用SS1Hp株以约109/ml的菌液,每次0.4 ml/只连续灌喂SPF级BABL/c小鼠4次,10 d完成,灌喂后8周经组织学等检查证实全部感染Hp后,随机分成5组,并灌喂:A组尿素酶+霍乱毒素B亚单位(CTB)+羟磷灰石(HAP),B组中药胃泰+尿素酶+CTB+HAP,C组单纯中药胃泰,D组尿素酶,E组为空白对照.
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gyrB基因和16S rRNA基因序列分析在沙门菌属细菌鉴别中的临床应用评价
近研究发现,gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因.gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因,其显著优点是基因进化率较快,碱基替换频率较高,在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性.本实验以10株沙门菌为受试对象,用PCR方法同时扩增其16S rRNA和gyrB基因,通过基因序列分析,比较两种基因对沙门菌的鉴别能力.
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重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位在大肠杆菌中的表达及免疫学分析
世界卫生组织已把幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)列为与胃癌发生有关的病原体,热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)是其致病因子之一.我们将Hp HspA亚单位基因克隆,并对其在大肠杆菌中的表达及免疫原性进行了研究.
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重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系.接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市.Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA63)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用.
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炭疽毒素对免疫细胞特异性影响的研究进展
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰阳性菌,是人兽共患炭疽病的病原体.炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的关键致病因子,是典型的A-B型细菌毒素,其中保护性抗原(protective antigen,PA)是结合亚单位,与靶细胞受体结合;致死因子(lethalfactor,LF)和水肿因子(edema factor,EF)是效应亚单位.
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危重急症患儿心肌肌钙蛋白Ⅰ监测的临床意义
自1987年Cummins首次测定血心肌肌钙蛋白诊断心肌梗死以来,该指标,尤其是抑制亚单位-cTnI引起了较多的关注.我们于1998年3月~1999年5月检测了不同病种29例危重急症患儿的cTnI,并与非危重患儿的cTnI值比较,分析危重急症小儿的cTnI动态变化.报道如下.