首页 > 文献资料
-
炭疽杆菌PA63蛋白原核表达及抗体检测间接ELISA方法的建立
目的 原核表达炭疽杆菌PA63蛋白,以此为包被抗原建立检测相应抗体的间接ELSIA方法,用于炭疽血清免疫学诊断. 方法 选择炭疽杆菌PA63为目的基因,合成全长序列,构建pCzn1-PA63质粒,克隆至E.coli ArcticExpress表达菌株,优化IPTG表达条件,通过包涵体变性复性,Ni柱纯化获得可溶性PA63蛋白.利用棋盘滴定法确定包被PA63蛋白的佳浓度及血清佳稀释度建立间接ELISA方法,对炭疽阳性血清和阴性血清进行检测,计算ROC曲线下面积,确定Cut-off值,灵敏度与特异度. 结果 成功构建了pCzn1-PA63质粒,IPTG 37℃诱导表达蛋白主要以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性,纯化后获得PA63蛋白.用5 μg/ml PA63包被酶标板,血清稀释度为1∶50建立的ELISA方法;ROC 曲线下面积为0.969(P<0.01),Cut-off值为0.2865时的灵敏度为91.18%(95%可信区间为76.32%-98.14%),特异度为94.64%(95%可信区间为85.13%-98.88%). 结论 成功表达具有生物活性的重组炭疽杆菌PA63抗原蛋白,以此为包被抗原建立的间接ELISA检测炭疽PA抗体,具有较高的灵敏度与特异度,可用于炭疽的血清学诊断.
-
A型流感病毒M2蛋白疫苗的研究进展
流感是由流感病毒引起的一种呼吸道传染病.目前应用的流感疫苗主要是针对流感病毒的膜蛋白HA和NA,但HA和NA存在抗原漂移和抗原转变问题,需要不断改换制备疫苗用的毒株.解决办法之一是研制一种"通用型"流感疫苗.M2蛋白是流感病毒第三种跨膜蛋白,具有离子通道作用,而且其基因序列高度保守.用M2蛋白或M2蛋白胞外区免疫小鼠可以有效保护小鼠免受致死性病毒攻击.因此,M2蛋白被认为是一种潜在的具有交叉保护性抗原,可用于开发通用型甲型流感疫苗.
-
炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达与纯化
目的在大肠杆菌中表达炭疽菌保护性抗原受体结合区. 方法将大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)的信号肽序列融合到炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区,即PA结构域4(PA-D4)基因的5′端,构建成分泌型表达质粒,在大肠杆菌中尝试 PA-D4的表达,并对重组蛋白进行纯化和鉴定. 结果重组PA-D4以可溶形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%.经过离子交换层析和凝胶过滤纯化,每升诱导培养物可获得约10mg PA-D4.蛋白N端测序表明PA-D4与天然序列一致.免疫印迹试验显示PA-D4可与抗PA血清结合. 结论在大肠杆菌中实现了PA-D4的分泌型表达,为进一步评估其作为新型疫苗和潜在治疗药物的可能性打下基础.
-
幽门螺杆菌18kD外膜蛋白的基因克隆、重组载体的构建
近年来,由于抗生素广泛的、大剂量的应用,导致耐药菌株的产生;鉴于此,不少研究工作者正致力于开发研究新的有效控制幽门螺杆菌引发疾病的疫苗.研制Hp疫苗至关重要的问题有三种:(1) 必须发现能干扰粘附和毒性且存在于所有菌株的保护性抗原;(2)临床前试验需要能模仿感染和疾病的动物模型;(3) 需要适合人体的粘膜佐剂.因此首先要寻找有效的保护性抗原.细菌的外膜蛋白是一种里外不对称、半通透性、
-
细菌性疫苗研究的新策略
目前人用细菌性疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗、多糖疫苗、多糖蛋白结合疫苗、基因工程蛋白疫苗和类毒素等.蛋白保护性抗原在细菌的不同血清型/群间具有较好的保守性,更适合用作广谱细菌性疫苗的候选抗原.研制细菌性蛋白疫苗的一个重要前提是筛选获得具有应用前景的细菌蛋白保护性抗原.
-
炭疽毒素对免疫细胞特异性影响的研究进展
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰阳性菌,是人兽共患炭疽病的病原体.炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的关键致病因子,是典型的A-B型细菌毒素,其中保护性抗原(protective antigen,PA)是结合亚单位,与靶细胞受体结合;致死因子(lethalfactor,LF)和水肿因子(edema factor,EF)是效应亚单位.
-
幽门螺杆菌黏附素HpaA的克隆、表达及生物学活性研究
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种慢性、感染率高的细菌,是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因子,并与胃癌、胃相关淋巴组织瘤密切相关.Hp感染基本的条件之一是黏附定居,N-乙酰神经氨酰乳糖结合血凝素(NLBH,HpaA)是Hp众多黏附素中的一种,可激发宿主产生相应抗体,引起黏膜和全身性免疫应答,针对它所产生的抗体不与非Hp细菌和人胃黏膜组织发生交叉反应,是Hp的保护性抗原之一.
-
口服鼠疫F1-Ⅴ重组融合蛋白活菌疫苗的构建及免疫效果的初步研究
鼠疫耶尔森菌能产生很多由染色体或质粒编码的毒力因子,包括pgm、pst、Yops、F1抗原、Ⅴ抗原等[1].F1和V抗原已被证实为主要保护性抗原,且存在属间保守性,F1-Ⅴ融合抗原分子在免疫原性和免疫保护性上具有叠加效应,将两者联合接种可保护小鼠抵抗109 LD50强度攻击[2].在鼠疫杆菌基因组、蛋白组和功能基因组研究的基础上,F1和Ⅴ是鼠疫新型疫苗研究首选的保护性抗原分子的靶标.
-
猪囊尾蚴保护性抗原cC1的疫苗研究
囊虫病是由猪带绦虫幼虫-囊尾蚴寄生于人和猪体引起的人、畜共患病,在我国囊虫病也有广泛的流行区域.抗原cC1是以囊虫病患者、病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出的具有高度特异性的人、猪共同抗原[1].以抗原cC1为目的基因构建了含有全长cC1 cDNA的重组质粒p3-cC1,同时制备并纯化了重组抗原cC1,以p3-cC1为DNA疫苗,cC1蛋白加弗氏佐剂为抗原佐剂疫苗,用这两种不同形式的疫苗免疫接种小鼠观察免疫应答.
-
重组BCG疫苗在传染病防治中的应用
卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)作为预防结核病的重要手段,已证明其对人体安全,且接种效果不受母体抗体的影响,成为WHO推荐的两种新生的活疫苗之一.BCG本身是强免疫佐剂,临床上常用于肿瘤治疗.近年来国内外学者以BCG为疫苗载体,将具有免疫保护作用的外源基因转入BCG[1],希望开发在BCG中表达保护性抗原或免疫因子的新一代活疫苗,以达到增强BCG免疫原性和一苗多用的目的.本文就重组BCG疫苗在传染病防治中的应用作一综述.
-
结核分枝杆菌保护性抗原的研究进展
结核分枝杆菌(MTB)蛋白根据蛋白分布的位置可分为分泌蛋白、胞质蛋白和膜蛋白.分泌蛋白是MTB在早、中期分泌释放于菌体外的一组蛋白,游离于培养基中或在感染细胞的吞噬小体内,在菌体内仅有微量存在;而胞质蛋白主要存在于细菌的细胞质中,在细菌对数生长的晚期细菌死亡后才释放到培养基中.将培养不超过5 d的滤液蛋白称为短期培养滤液蛋白,这是记忆性免疫CD+4T淋巴细胞的靶分子;将培养7 d以上的滤液蛋白称为长期培养滤液蛋白,随着培养时间的延长,滤液中蛋白越来越多,由于部分MTB开始裂解死亡,释放胞质蛋白,培养42 d时滤液中已有100多种蛋白质.结核病保护性免疫主要是细胞免疫,诱导细胞免疫反应的抗原主要存在于细胞壁、细胞质和培养滤液中,其中分泌蛋白和细胞壁表面的蛋白是主要的免疫保护性抗原,将成为新疫苗研究的首选靶抗原.现将保护性抗原的编码基因、生物学特性、免疫学功能等介绍如下.
-
结核分枝杆菌分泌蛋白64抗原模拟表位的筛选研究
MTB分泌蛋白64(MPT64)是MTB重要的保护性抗原,也是结核病血清学诊断的理想抗原之一[1].然而目前报道MPT64抗原对血清标本的直接检出率较低[2].20世纪80年代兴起的噬菌体展示随机肽库(phage display peptide library)技术是一种快捷、高效分析蛋白分子间相互作用的工具[3],尤其适于筛选生物活性大分子的配体.
-
结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素-2的融合蛋白诱导小鼠免疫应答及保护力的研究
热休克蛋白65(Hsp65)是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染过程中一个重要的保护性抗原,具有很强的免疫原性[1],而白细胞介素-2(IL-2)是一种辅助性T淋巴细胞(Th1)型的细胞免疫佐剂,不仅可增强机体的免疫应答,而且可以诱导机体的免疫反应向Th1型方向发展[2].
-
炭疽保护性抗原第四结构域基因在重组SFV复制子载体中的表达
目的:构建炭疽毒素保护性抗原第四结构域PA4基因的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子载体,并观察PA4抗原在重组SFV复制子载体中的表达.方法:将PA4基因克隆到基于RNA和DNA的SFV复制子表达载体中,获得的重组SFV复制子载体直接转染BHK21细胞,通过间接免疫荧光和Western印迹试验检测PA4在细胞中的表达;与辅助病毒载体共转染制备重组病毒颗粒,通过间接免疫荧光和Western印迹检测PA4在重组病毒颗粒感染细胞中的表达.结果与结论:成功地构建了基于RNA和DNA的PA4重组SFV复制子载体,并且在体外基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体能够在细胞中有效地表达非分泌型和分泌型的PA4抗原,制备了具有感染能力并能表达PA4抗原的重组病毒颗粒,为进一步以SFV复制子作疫苗载体观察炭疽新型复制子疫苗的免疫原性奠定了基础.
关键词: Semliki森林病毒 复制子 炭疽毒素 保护性抗原 重组病毒颗粒 -
A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析
目的:在酵母系统中实现A型肉毒毒素(BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达.方法:将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacⅠ将重组质粒线性化,电转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115细胞,筛选G418抗性阳性整合子,进行Mut+表型株甲醇快速利用诱导.结果:经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化,毒素Hc在pH 6.5培养基 BMMY中实现稳定的分泌表达,终筛选到蛋白表达量占上清蛋白10%的分泌高表达株.免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组BoNTa Hc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性,可以诱导小鼠产生特异性抗体.结论:酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子.
-
炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析
目的:构建pET-32a(+)-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a(+)载体的Trx编码区融合产生pET-32a(+)-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a(+)-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2+金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a(+)-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.
-
炭疽毒素受体及其与保护性抗原结合机制的研究进展
本文阐述了炭疽毒素的细胞表面受体研究及其与保护性抗原结合分子机制等方面的进展.到目前为止,共发现两种炭疽毒素受体,分别由TEM8和CMG2基因编码.炭疽毒素受体的发现和鉴定对炭疽的病理学研究具有重要的意义,而且体外实验发现的受体与毒素的高亲和力也为受体本身作为炭疽的治疗剂带来了希望.CMG2和PA结合状态晶体结构的解析使我们能够对毒素进入细胞质过程的分子细节有所推论.所建立的理论模型为研究其他类型穿透细胞膜发挥作用的毒素的作用过程提供了重要的参考.
-
炭疽毒素小分子抑制剂
炭疽病是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的恶性传染病,炭疽菌进入宿主后产生的炭疽毒素是感染者致死的主要原因.炭疽毒素含有2种具有酶催化活性的蛋白质——致死因子和水肿因子,以及1种共同的结合和转运蛋白质——炭疽保护性抗原,炭疽保护性抗原分别与上述两种因子组成致死毒素和水肿毒素.现阶段治疗炭疽病的主要药物为抗生素,但抗生素只能杀灭人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌,不能抵抗孢子和细菌在体内产生的毒素,因而需要开发抑制炭疽毒素的新型药物.本文主要综述近年来国际上对靶向保护性抗原、致死因子和水肿因子的炭疽毒素小分子抑制剂的主要研究进展.
-
狂犬病毒3aG株核蛋白基因的克隆及序列分析
狂犬病毒的包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)和核蛋白(nucleoprotein,NP)是主要的保护性抗原,一般认为,NP诱导的细胞免疫在狂犬病毒感染后起更为重要的作用.文献报道以不同病毒载体表达的NP,可使受攻击的小鼠具有更强的保护效力和较长的存活时间.为研究狂犬病毒3aG株NP的分子生物学特性及其在狂犬病毒基因工程疫苗中的作用,本研究对NP基因进行了克隆和序列分析.
-
炭疽双组分疫苗的研究
目的 通过研究由重组炭疽保护性抗原与灭活炭疽芽孢杆菌菌体抗原组成的炭疽候选疫苗免疫小鼠,对其免疫效果进行评价.方法 将小鼠随机分成4 个实验组,在免疫后不同时间点采血进行抗体检测、MTT 法淋巴细胞增殖试验、ELISPOT 法IFN-γ细胞因子的测定以及保护力试验.结果各组疫苗均能诱导较强的体液免疫应答.第3 周rPA 组及rPA +炭疽菌体组经rPA 抗原刺激后的刺激指数均高于对照组(P < 0.05).ELISPOT结果显示,各实验组经特异性抗原刺激后均有较高的IFN-γ分泌.rPA 抗原与炭疽菌体抗原有较好的保护力,由rPA 与炭疽菌体组成的疫苗对炭疽活芽孢的攻击保护率为100%.结论 由rPA 抗原与灭活炭疽菌体抗原组成的新型炭疽疫苗能诱导小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答,具有较好的保护力,该疫苗有希望成为新一代炭疽疫苗.