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区分孕期巨细胞病毒原发与非原发感染的ELISA方法的研究
目的:根据机体对巨细胞病毒重组抗原pp52和pp150不同的IgG免疫反应,建立一种快速、简便和适用的ELISA方法,用于区分孕妇巨细胞病毒近期原发与非原发感染.方法:应用间接ELISA方法测定巨细胞病毒两种重组抗原pp52和pp150 IgG,计算pp52 OD与pp150 OD的比值(pp52 OD/pp150 OD).结果:共检测858份血清,其中812例为既往感染,46例为活动性感染(15例为原发感染、31例为继发或再感染).当以pp52 OD/pp150 OD比值>1.5作为原发感染标准时,4组的阳性率分别为1.5%、32.6%、66.7%和16.1%,各组间差异有统计学意义(P<0.05),方法的敏感性和特异性分别为66.7%和98%.结论:本研究建立的测定巨细胞病毒重组蛋白pp52 OD/pp150 OD的酶联免疫吸附方法是辅助区分巨细胞病毒原发与非原发感染的较好的血清学方法,有待扩大样本量进一步证实.
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庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究
利用原核表达载体pRSET或(和)pGEX在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒(HGV)C-NS3和NS5区的多段基因.CE1、E2、NS3、NS5及NS3-NS5嵌合基因等的8段基因均有高效表达,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在10%～35%之间.对以上重组蛋白进行免疫学筛选,证实其中7个重组蛋白均具免疫学活性,在一定程度上确定了重组HGV抗原表位的分布,为HGV的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定了坚实基础.
关键词： 庚型肝炎病毒(HGV)基因 原核表达 重组抗原 免疫学活性 -
SDS 和2-ME在HCV重组抗原包被工艺中的应用
为提高间接ELISA法检测抗-HCV诊断试剂盒的灵敏度,将含有十二烷基硫酸钠(SDS)与巯基乙醇(2-ME)的包被液对HCV重组抗原的固相化,与不加入上述上述两种化学物质的包被液进行对比.结果发现,在包被液中加入适宜浓度的SDS和2-ME,有效的提高了间接ELISA检测抗-HCV试剂的灵敏度,而试剂的特异性则保持不变,优化了临床标本的反应模式.在包被液中同时加入SDS和2-ME,有效的改变了HCV重组抗原的包被效果,优化了抗-HCV诊断试剂盒的生产工艺.
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自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析
探讨自身抗原SSA/Ro-52kD的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据.根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析,采用PCR法克隆自身抗原SSA/Ro-52kD多肽片段的cDNA,定向插入表达载体PGEX-5X-1,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用GST亲和层析柱进行纯化,经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应.结果表明片段Ro523具有较强的抗原性.这提示SSA/Ro-52kD 的抗原优势表位主要存在于170~270位.
关键词： 自身抗原SSA/Ro-52kD 表位分析 重组抗原 免疫印迹 -
寻常型天疱疮的Dsg3特异性抗体反应及其基因限制性
探讨寻常型天疱疮中的自身抗原桥粒芯蛋白(Dsg3)特异性抗体反应及其基因限制性,为自身免疫性疾病机制的研究提供依据.采用RT-PCR法克隆自身抗原Dsg3E1,E2,E3,E4,E5多肽片段的cDNA,定向插入表达载体PGEX-2T,导入大肠杆菌JM109中表达重组融合蛋白并经GST层析柱纯化,进一步经免疫印迹法与PV患者阳性血清反应;应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)技术对HLA-Ⅱ类等位基因进行特异性体外扩增,分析了天疱疮患者HLA基因的DR位点和DRB1、DQB1多态性.Dsg3 E1,E2和E4可与PV患者阳性血清反应,而不与疾病对照组、正常对照组反应.在10个PV患者中,均携带HLA的DR4或/和DR14抗原,有7个DRB1*0402,4个DRB1*1401,7个DQB1*0302,4个DQB1*0503.Dsg3E1,E2和E4中包含抗体反应相关的抗原表位,HLA DRB1*0402和DQB1*0302与PV发病中抗E4抗体反应密切相关.
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常用基因表达系统的特点及其在寄生虫抗原制备中的应用
寄生虫病仍然是威胁人类健康的重要疾病.与细菌及病毒不同,大多数寄生虫为多细胞生物,其抗原成分复杂,抗原结构随着寄生虫的生长发育而不断变化.即使是单细胞寄生虫如原虫,抗原结构也随着虫期的转换而发生变异.由于寄生虫抗原构成的复杂性、多变性及大多数寄生虫尚未建立人工体外培养技术,通过基因工程技术大量制备寄生虫重组抗原对寄生虫病的诊断与防治就显得尤为重要.如何根据基因表达系统的特点选择合适的体系获得高效表达,是研究中常常面临的重要问题.
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捻转血矛线虫抗原研究进展
捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物的一种重要消化道线虫,寄生于宿主第四胃,以宿主血液为其营养来源.感染牛、绵羊和山羊,引起动物贫血及贫血综合征,严重的可致动物,特别是羔羊大批死亡.该病主要采用化学药物治疗,取得了很好的效果,但存在严重的药物残留问题.抗药虫株的出现和蔓延,使得传统的化学治疗受到了严重挑战,这给畜牧业生产带来了极大的经济损失(Waller,1996).应用免疫学方法防治该病十分迫切和必要,本文主要就捻转血矛线虫抗原的种类、免疫保护效果以及重组抗原研究情况作如下概述.
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梅毒螺旋体Tp0259假定蛋白的原核表达、纯化及活性研究
目的 表达、纯化梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0259 (rTp0259),鉴定其免疫原性,并探讨其在梅毒血清诊断中的价值.方法 PCR扩增tp0259基因,构建pET-28a(+)/Tp0259原核表达载体,转化至E.coli BL21中诱导表达.采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,并进行Western blot鉴定.以重组蛋白Tp0259为抗原,采用Western blot方法检测梅毒患者血清(一期梅毒患者血清21份,二期梅毒患者血清13份,潜伏梅毒患者血清6份,并与梅毒诊断金标准比较).结果 PCR扩增获得600 bp左右大小的目的基因片段并成功构建原核表达载体pET28a-Tp0259,经诱导高效表达分子质量单位为28 ku的重组蛋白.Western blot证实该重组蛋白为Tp0259假定蛋白,能被梅毒患者血清识别.以Tp0259为抗原采用Western blot检测梅毒患者血清特异性抗体结果与梅毒诊断金标准(临床症状、病史结合血清学诊断方法)间的κ值为0.944,表明这两种方法检测结果的一致性较好.结论 成功表达、纯化了可溶性rTp0259,该蛋白具有良好的免疫反应性并具有较高的血清学诊断价值.
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耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白合成及人群IgG抗体调查
目的 原核表达耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)主要表面糖蛋白(major surface glycoprotein,Msg)氨基端片段,获得可溶性Pj重组Msg抗原(recombinant Msg,rMsg),利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测266例成年人外周血抗Pj rMsg IgG抗体. 方法 从耶氏肺孢子菌感染者的痰液获得Pj DNA,构建表达载体pGEX-3X-Pj Msg,转化感受态大肠埃希菌DE3,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用谷胱甘肽转移酶(GST)标签进行亲和纯化,对纯化Pj rMsg抗原进行鉴定并建立ELISA方法,检测266例成年人外周血抗Pj rMsg IgG抗体. 结果 成功构建了表达质粒pGEX-3X-Pj Msg,并诱导表达分子质量单位约39 ku的可溶性Pj rMsg蛋白,产量为13 mg/500ml菌液,以此为抗原,采用ELISA检测266例成年人外周血抗Pj rMsg IgG抗体,阳性率为42.5％(113/266).其中男、女性患者阳性率分别为43.3％(58/134)和41.7％(55/132),差异无统计学意义(x2=o.071,P＞0.05);20～29岁、30～39岁、40～50岁组阳性率分别为31.8％(27/85)、48.3(42/87)和46.8％(44/94),差异无统计学意义(x2=5.911,P＞0.05). 结论 成功表达了可溶性Pj rMsg抗原,Pj rMsg-ELISA检测结果表明北京地区成人耶氏肺孢子菌感染率较高.
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卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定
目的表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwAg)基因,并评价其应用于免疫学诊断的价值. 方法用IPTG诱导表达已亚克隆入表达载体pRESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因,以SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物. 结果 SDS-PAGE电泳可见32 ku处有1条明显的蛋白质带,该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别. 结论成功构建重组克隆PwAg,其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性,推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断.
关键词： 卫氏并殖吸虫成虫 重组抗原 表达 Western blotting -
佐剂FCA与Quil A对rGST-Sj32的免疫增强作用的比较
目的比较弗氏完全佐剂(FCA)与皂素的纯化物Quil A的免疫增强作用,进一步提高重组抗原rGST-Sj32的免疫效果.方法rGST-Sj32+FCA或Quil A免疫NIH小鼠3次,ELISA法检测抗体水平,用减虫率及减卵率表示保护效果.结果与PBS对照组比较,rGST-Sj32+FCA免疫小鼠减虫率为42.9%,每克肝卵(LEPG)减少率51.0%,每雌肝卵(LEPF)减少率为23.9%,抗体滴度达1:25 600.rGST-Sj32+Quil A免疫小鼠减虫率为46.0%,LEPG减少率39.4%,LEPF减少率为8.5%,抗体滴度达1:51 200.结论FCA和Quil A均可增强rGST-Sj32免疫小鼠的抗感染保护性免疫力;FCA亦可增强rGST-Sj32诱导小鼠抗生殖免疫,Quil A无增强抗生殖免疫的作用.
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重组抗原在弓形虫病诊断中的应用
刚地弓形虫感染危害严重,研究敏感性高和特异性好的弓形虫感染检测方法对于弓形虫病的诊断至关重要.弓形虫病的诊断一般依赖于检测患者血清中弓形虫特异性IgM和IgG.目前,商业试剂盒大多采用天然抗原,其检测精确性较差.重组抗原已经被发展用来诊断弓形虫病,且具有潜在的应用价值.本综述主要介绍重组抗原在弓形虫病诊断中的应用.
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囊虫病免疫诊断候选抗原研究进展
猪囊尾蚴免疫诊断抗原的研究是囊虫病免疫诊断的基础.猪囊尾蚴抗原成分复杂,特别是虫体粗抗原,与多种寄生虫存在明显的交叉抗原成分,影响检测的特异性.近年来随着分子生物学的发展,重组抗原制备简单,检测效果良好,已成为囊虫病免疫诊断研究的热点.本文对近年来囊虫病免疫诊断抗原的分子生物学研究进展进行了综述.
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登革重组抗原与登革IgM抗体反应的敏感性和特异性分析
选用登革病毒1-4型E蛋白(包膜糖蛋白)型特异性多肽(约120个氨基酸)作抗原,重组抗原在大肠杆菌(E.coli)中表达,采用多步液相层析进行纯化.本文对该抗原的敏感性和特异性进行了分析,为开发"登革病毒IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒"进行了基础研究.
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丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原异质性分析
目的探讨不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白的抗原特性及其用于抗-HCV检测的意义. 方法分别构建和表达含有HCV 1型和6型NS3基因片段的重组质粒和重组蛋白,以ELISA法和Western blot分析不同基因型重组蛋白与已知抗-HCV阳性血清的抗原反应性. 结果 HCV 1型和6型NS3重组蛋白氨基酸序列的同源性为83.2%;85份抗-HCV阳性血清以此不同基因型HCV NS3单片段抗原检测,阳性检出率分别为61.2%(1型)和58.8%(6型),其中有7份标本以NS3-1型抗原检测阴性,但可被NS3-6型抗原检出,反之,有9份血清以NS3-6型重组蛋白检测为阴性,而NS3-1型检测阳性;54份大学生体检血清和39份阴性质控血清以此两种抗原检测均为阴性. 结论 HCV 1型和6型NS3重组蛋白存在抗原异质性,在发展HCV抗体检测试剂时需考虑加入不同基因型的NS3抗原.
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猪囊尾蚴保护性抗原cC1的疫苗研究
囊虫病是由猪带绦虫幼虫-囊尾蚴寄生于人和猪体引起的人、畜共患病,在我国囊虫病也有广泛的流行区域.抗原cC1是以囊虫病患者、病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出的具有高度特异性的人、猪共同抗原[1].以抗原cC1为目的基因构建了含有全长cC1 cDNA的重组质粒p3-cC1,同时制备并纯化了重组抗原cC1,以p3-cC1为DNA疫苗,cC1蛋白加弗氏佐剂为抗原佐剂疫苗,用这两种不同形式的疫苗免疫接种小鼠观察免疫应答.
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重组主要表面抗原1用于弓形体病IgG免疫诊断的研究
目的用纯化的重组刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(SAG1)作为检测抗原,建立间接法rSAG1-ELISA,检测弓形虫IgG抗体并与国外进口试剂盒进行比较,以观察其阳性和阴性符合率;并对rSAG1-ELISA检测的精确度、灵敏度和特异性进行评价. 方法接种重组菌至LB肉汤中,IPTG诱导表达后,用Ni2+螯合柱进行亲和纯化;分别用不同浓度的重组抗原rSAG1包被聚苯乙烯酶标条,检测不同稀释度的阳性和阴性血清,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗,采用正交试验确定rSAG1-ELISA的佳检测条件;按rSAG1-ELISA法的佳检测条件对混合弓形虫IgG阳性和阴性血清重复测20次进行精确度的检测;采用抗体抑制试验检测其特异性;同时对用进口试剂盒筛得的52份弓形虫IgG阳性血清和40份弓形虫IgG阴性血清进行检测. 结果制备的rSAG1重组蛋白纯度在90%以上;以该重组抗原建立的rSAG1-ELISA的佳检测条件为:重组抗原rSAG1的包被浓度为5μg/ml,血清稀释度1∶100,酶标记的羊抗人IgG 1∶2000稀释;用rSAG1-ELISA对混合弓形虫IgG阳性和阴性血清的重复检测表明:IgG阳性血清的检测值的变异系数(CV值)为10.9%,IgG阴性血清的CV值为10.7%;灵敏度检测表明血清稀释度在1∶50～1∶200均可检出阳性;特异性试验的抑制率为62.6%;rSAG1-ELISA与进口试剂盒的总符合率为87%,其中阳性和阴性符合率分别为81%(42/52)和95%(38/40). 结论 rSAG1-ELISA具有较好的灵敏性和特异性,与进口试剂盒相比有较高的符合率,表明该法具有较好的弓形体病诊断价值,可进一步推广应用.
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HIV-1 gag基因p17+24重组抗原表达、纯化及抗原性分析
目的 获得HIV-1型gag基因p17+24重组抗原,分析其免疫原性和探讨开发诊断试剂的可能性.方法 采用PCR技术扩增HIV-1 gag基因p17+p24核酸片段,并克隆入pTrcHis2A表达质粒,在大肠杆菌BL21(DK3)株中表达.用Ni-NTA金属螯合层析法纯化目的蛋白,并用免疫印迹法分析纯化蛋白的抗原特异性.结果 重组质粒在BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达一个相对分子质量(Mr)约为51×103的融合重组蛋白,重组蛋白经HIV-1 p17、p24抗原单克隆抗体鉴定,具有抗原特异性.25份HIV阳性血清、180份HIV阴性血清标本初步经临床验证,具有较高的检出敏感性和特异性.结论 成功构建HIV-1型gag基因p17+24抗原表达载体,表达纯化的p17+24重组抗原具有较好的抗原性,可用于诊断试剂的开发.
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重组抗原酶联免疫吸附试验检测人疱疹病毒6型抗体的研究
人疱疹病毒6型(HHV-6)与幼儿急疹(ES)、良性和恶性淋巴增生性疾病、慢性疲劳综合征及多发性硬化症等发生有关,在免疫功能低下患者可引起致死性感染.
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人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用
我国临床人细小病毒B19(B19)感染的诊断和流行病学调查以及献血员筛查等方面的工作尚未广泛开展,原因之一是受诊断试剂和方法的局限.目前国际上商业B19抗体诊断试剂盒均以重组抗原为基础.本研究获取能表达B19结构蛋白VP1独特区和VP1/VP2共同区主要抗原片段,建立改良酶联免疫吸附法(ELISA),检测发病期患者和献血员血清中抗B19-IgM,并与德国IBL试剂盒平行比较.
