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EGFR抑制剂细胞磷酸化筛选模型的建立与应用
表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶(PTK)活性的跨膜糖蛋白受体,由 N 端胞外区、跨膜区、胞内区 3 部分组成,胞内区共 542 个氨基酸残基,由近膜区、酪氨酸激酶区、C 末端等 3 个亚区构成,近膜区的前13 个氨基酸(645 ~ 657)介导胞内二聚化[1].自身磷酸化位点位于 C 末端,其中 Tyr1068 为主要的 3 个磷酸化位点(Tyr1068、Tyr1148 和 Tyr1173)之一,与细胞信号传递密切相关[2].表皮生长因子(EGF)与 EGFR 胞外区 N 端结合,受体之间二聚化形成同源或异源二聚体,二聚体促使EGFR 胞内区氨基酸残基自磷酸化,进而启动胞内信号通路,调控癌细胞的增殖、存活及凋亡[3].
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A型流感病毒M2蛋白疫苗的研究进展
流感是由流感病毒引起的一种呼吸道传染病.目前应用的流感疫苗主要是针对流感病毒的膜蛋白HA和NA,但HA和NA存在抗原漂移和抗原转变问题,需要不断改换制备疫苗用的毒株.解决办法之一是研制一种"通用型"流感疫苗.M2蛋白是流感病毒第三种跨膜蛋白,具有离子通道作用,而且其基因序列高度保守.用M2蛋白或M2蛋白胞外区免疫小鼠可以有效保护小鼠免受致死性病毒攻击.因此,M2蛋白被认为是一种潜在的具有交叉保护性抗原,可用于开发通用型甲型流感疫苗.
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靶向融合防龋重组质粒pGJA-P免疫定菌鼠的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans,S. mutans)是公认的主要致龋菌,细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs)是S.mutans的重要致龋毒力因子.我们构建了同时针对PAc和GTF的融合防龋重组质粒pGLUA-P,经动物实验证实确有防龋作用.Boyle等提出同时表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)和目的抗原融合蛋白的DNA疫苗能加快和增强免疫反应,原因是通过CTLA4与APC表面的B7结合,目的抗原被靶向引导至APC,从而加强了APC对目的抗原的提呈作用.据此我们在pGLUA-P中引入编码人CTLA4胞外区和Igγ1恒定区的基因,构建出靶向融合防龋重组质粒pGJA-P.本实验用pGLUA-P和pGJA-P重组质粒免疫定菌鼠,观察CTLA4的靶向作用对免疫效果的影响.
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Klotho在CKD-MBD及急性肾损伤中的新认识
Klotho基因是Kuro[1]等于1997年发现的与衰老有关的新基因,并用古希腊神话中纺织生命之线女神的名字命名.Klotho基因被敲除的小鼠(kl-/-小鼠)可出现类似人类衰老的各种表型,如寿命缩短、听力下降、不育症、动脉硬化、软组织钙化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿等.1 klotho基因及蛋白Klotho基因长50kb,由5个外显子和4个内含子组成.其表达的蛋白在人和小鼠中均有膜结合型和分泌型两种形式,分泌型的量明显高于膜结合型,但在大鼠中尚未发现有分泌型klotho蛋白的基因结构.klotho基因5个外显子全部表达则产生由1,012个氨基酸(小鼠)或1,014个氨基酸(人和大鼠)组成的膜结合型klotho蛋白[2].膜结合型klotho蛋白的特点是:胞外段较长、胞内段和跨膜区较短.klotho蛋白胞外区可被解聚素-金属蛋白酶(a disintegrin and metal]oproteinase,ADAM)水解.分泌型蛋白含有549个氨基酸,不含kl 2胞外区、跨膜区和胞内区.循环中的klotho蛋白可以来源于klotho基因选择性转录、mRNA选择性剪切而生成的可溶性型klotho,也可来源于被ADAM水解脱落的膜型klotho蛋白的胞外部分[3].
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HAb18Gedomab1单抗的制备及功能研究
目的:制备抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白(HAb18Ged)的单抗HAb18Gedomab1,并对其理化性质和生物学功能进行分析鉴定.方法:用HAb18Ged免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术,融合并筛选分泌抗人HAb18Ged蛋白单抗的杂交瘤细胞株,制备腹水,采用离子交换层析法纯化该抗体.采用流式细胞术、免疫组化等方法对其特异性进行鉴定,并通过明胶酶谱、Ⅰ型胶原酶谱、重组基底膜降解实验研究该抗体的体外生物学功能.结果:获得一株稳定分泌抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白单抗的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1,滴度为:1:106,纯化后HAb18Gedomab1单抗的纯度大于90%,抗体亚型属IgG1型.流式细胞术及免疫组化结果证明,该抗体与FHCC-98细胞膜抗原及肝癌组织均呈特异性结合.生物学功能研究表明,HAb1 8Gedomab1可刺激鼠成纤维细胞(3T3)分泌明胶酶MMP-2,MMP-9及胶原酶MMP-1,MMP-8,并具有促进基底膜降解的作用.结论:HAb18Gedomab1单抗可特异识别HAb18Ged,刺激MMPs分泌,促进基底膜降解.
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FMS样酪氨酸激酶3及其突变与白血病
FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3,FLT3),也称为胎肝激酶2(fetal liver kinase-2, FLK-2)和人干细胞激酶1(human stem cell kinase-1, STK-1),是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(class Ⅲ receptor tyrosine kinase, RTKⅢ)家族成员之一,于1991年由两个研究小组分别克隆.FLT3与其他RTKⅢ家族成员包括集落刺激因子1受体(CSF1R或FMS)、血小板衍化生长因子(PDGFR)、干细胞因子受体(KIT)等基因序列非常相似,其蛋白结构均包括5个Ig样结构域组成的胞外区,一个跨膜区,一个近膜区(juxtamembrane, JM),以及胞内由激酶插入区分隔而成的两个酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)区.
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应用针对前列腺特异膜抗原胞外区的单克隆抗体J591靶向定位前列腺转移癌
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曲妥珠单克隆抗体辅助治疗HER-2阳性早期乳腺癌的荟萃分析
乳腺癌是美国及西欧妇女常见的癌症.大约25%早期浸润性导管癌有HER-2/neu基因的扩增.曲妥珠单克隆抗体是第一个用于临床针对HER-2/neu的靶向治疗药物,是直接作用于HER-2/neu蛋白胞外区的人源化单克隆抗体.
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抑制SARS病毒侵染宿主细胞的多肽药物的研制
囊膜病毒一般通过囊膜上的糖蛋白和宿主细胞膜上的受体识别,然后介导病毒囊膜和细胞膜的融合,从而病毒释放内部基因组和蛋白而侵染细胞.这种糖蛋白在不同囊膜病毒中,结构上具有很大的相似性,包括一个很大的胞外区、一个跨膜螺旋锚定蛋白区和一个从20到150个氨基酸大小不等的胞内区.这类糖蛋白前体表达后,水解成密切相关的两个亚单位,然后形成多聚体 (一般是三聚体).这种糖蛋白一般具有一段称为"融合肽"的序列,这段序列副含疏水氨基酸和甘氨酸,可以作用于宿主细胞膜来介导膜的融合[1].
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细胞间粘附分子-1检测的临床应用进展
细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)属于免疫球蛋白超家族成员[1].是一种单链糖蛋白,肽链可分为N-末端的胞外区、跨膜区和C-末端的胞质区,ICAM-1的胞外区有5个免疫球蛋白样功能区,它的第一功能区是白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的结合部位.ICAM广泛分布于内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞表面,但在正常情况下,许多细胞不表达或很少表达,其配体为整合素家族的CD11a/CD18、CD11b/CD18.ICAM-1表达可因肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素-γ、内毒素等炎症介质的刺激而上调,即使内皮细胞在静止状态下就表达较高水平的ICAM-1,但经细胞因子刺激后ICAM-1的上调表达仍对中性粒细胞与内皮细胞的粘附起重要作用.同白细胞介素-2、6受体一样,ICAM-1也存在膜型和可溶性(sICAM-1)两种形式,sICAM-1的总体结构与膜型ICAM-1胞外区结构非常相似,ICAM-1作为许多炎症疾病病情观察的重要免疫学指标备受关注.
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神经营养因子低亲和力受体p75NTR信号通路的研究进展
神经营养因子(neurotrophins)组成了一个非常保守的蛋白家族,它们在神经系统的功能和发育中起着至关重要的作用〔1〕。这种作用是通过细胞表面的两种受体来实现的,一类是Trk受体,这是一种酪氨酸激酶,可以较高的亲和性分别与各自的配体结合(TrkA/NGF,TrkB/BDNF、NT4、5,TrkC/NT3)〔2〕;另一类是神经营养因子低亲和力受体p75NTR(p75 neurotrophin receptor),它属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族,该家族成员还包括CD27、CD30、CD40、41BB、OX40、Fas抗原、TNFR1和TNFR2〔3〕。这些蛋白共有的特点是在胞质区有长约80个氨基酸的死亡结构域(death domain,DD),而胞外区则有半胱氨酸富集的结构域〔4〕。与高亲和力受体Trk不同的是,所有神经营养因子都能以相同的亲和力与p75NTR结合〔2〕。
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抗人重组可溶性组织因子单克隆抗体的制备及鉴定
组织因子(TF)作为血液凝血因子Ⅶ(FⅦ)和活化的血液凝血因子Ⅶ(FⅦa)的受体和辅助因子,是生理性和病理性凝血过程的始动因子.可溶性组织因子(sTF)为TF的胞外区(1~219氨基酸),具备TF连接FⅦa及催化FⅦa所必需的全部结构.sTF作为抗原较全长TF具有相对分子质量小、针对性强的特点.我们以重组人可溶性组织因子(rhsTF)为抗原,制备了抗rhsTF单克隆抗体(McAb),并对抗体进行了鉴定.
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CD45RA/CD45RO T淋巴细胞检测的临床意义
CD45是白细胞共同抗原,属I型跨膜蛋白,其胞浆端具有酪氨酸磷酸酶活性.CD45RA/CD45RO是CD45的两种亚型,由CD45肽链胞外区氨基端的三个外显子(A、B和C)发生旁路剪接而形成.缺乏三种外显子的同型称为CD45RO,仅表达外显子A的同型称为CD45RA.
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B细胞活化因子/增殖诱导配体在类风湿关节炎发病机制及治疗中的研究进展
B细胞活化因子(B cell activating factor of the TNF family,BAFF)是Schneider等于1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族的新成员,又叫做B细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)~([1-2]).BAFF是由283个氨基酸残基组成的相对分子质量为313 000的Ⅱ型跨膜蛋白,可分为胞内区、跨膜区、胞外区3个部分.其N端的1~46位氨基酸为胞内区片段.47~73位氨基酸为跨膜区片段,其余为胞外区片段~([1]).
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乳腺癌病人抗HER2/neu阳性血清的筛选
HER2/neu是一种原癌原因,编码的p185跨膜糖蛋白具有受体酪氨酸激海性.HER2/neu基因的扩增和/或p185蛋白的过度表达可见于20%~40的乳腺癌病人[1].抗HER2/neu胞外区的抗体可抑制肿瘤细胞的生长,而用于临床乳腺癌的治疗[2,3].本文旨在探索乳腺癌病人体内对HER2/neu蛋白的体液免疫应答,分析其对细胞增殖的影响.
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HER-2/neu胞外区基因疫苗的免疫避孕作用
目的:研究HER-2/neu胞外区基因疫苗在免疫避孕中的作用.方法:构建含人HER-2/neu胞外区的重组质粒pcDNA3-hECD,以该质粒转染真核细胞C2C12或注射小鼠股四头肌,检测其在体内外表达情况;以该质粒基因免疫雌性BALB/C小鼠,部分小鼠于第12周以重组蛋白hECDu加强免疫,以ELISA方法检测抗HER-2/neu抗体应答,3H-TdR掺入法检测细胞免疫应答,并观察其诱导免疫避孕的情况.结果:C2C12转染上清及小鼠股四头肌注射局部均可检测到hECD蛋白的表达.小鼠经基因免疫后可产生较高水平抗体应答,抗体水平至少维持28周,同时可检测到较高水平细胞免疫应答(pcDNA3-hECD与对照组SI值分别为9.55和1.25);基因免疫后小鼠平均产仔数(3.8±2.9,对照组为9.7±1.6)明显降低,以蛋白加强免疫后产生特异性回忆反应,平均产仔数进一步降低(2.0±1.7).而且,免疫小鼠产后4天子宫及卵巢与正常产后鼠相比均无明显区别.结论:基于HER-2/neu胞外区的基因疫苗免疫小鼠可诱导有效的免疫应答并产生一定免疫避孕效果,并且这种避孕作用经特异性蛋白加强免疫可进一步得以提高.
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小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达
目的 克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Ra)胞外区基因.方法 采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增slL-5Ra胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPRO EX中,构建重组表达质粒pPRO EX/slL-5Ra,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达.采用SDS-PAGE和Western blot检测目的 蛋白的表达.结果 重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确.表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36 100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠slL-5Rα单抗发生特异性免疫反应.结论 已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础.
关键词: 可溶性IL-5受体α 胞外区 克隆 原核表达 -
人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达
目的 克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法 从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化.结果 从SK-Br3细胞系中扩增出387 bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5 mmol/L时,目的蛋白的表达量高;纯化后重组蛋白浓度为1.5 mg/ml.结论 已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原.
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抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备
目的 制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体.方法 用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/O细胞融合.捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体.间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析.将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后.检测细胞培养上清的效价.结果 3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10~(-6),杂交瘤细胞染色体数介于94~98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位.细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定.结论 已成功制备了3株町稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础.
关键词: 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 胞外区 单克隆抗体 捕获ELISA -
组织因子在食管鳞癌中的表达及其临床意义
食管鳞癌是常见的上消化道恶性肿瘤,其死亡率高居恶性肿瘤死亡率第2位.食管鳞癌的治疗目前主要有外科、放射,药物及免疫治疗等.对于Ⅱ期以上的病例,单一的治疗方案往往效果不佳,故多采用综合治疗.组织因子又称凝血因子Ⅲ.是一相对分子质量为47×103的单链跨膜糖蛋白.由263个氨基酸残基组成,包括胞外区、跨膜区、胞内区三个结构域[1].