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改善HIV-1 DNA疫苗免疫原性的方法
1 HIV-1 DNA疫苗的特点自1981年首次发现艾滋病以来,艾滋病病毒(HIV)的感染在全世界迅速广泛流行.到2000年底,我国在HIV感染人数已达60万.由于药物的昂贵和耐药株的产生影响艾滋病的治疗.科学家认为预防HIV传播的佳措施是研制和应用安全而有效的预防性疫苗,而且认为研制有效的HIV疫苗是可行的.目前科研人员研究了多种类型疫苗,其中引人关注的是基因疫苗.
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C3d3与hCGβ基因融合质粒对不同品系小鼠DNA免疫增强抗hCGβ体液免疫效应
目的 通过分子佐剂C3d3增强人绒毛膜促性腺激素(hCG)β基因疫苗在不同品系小鼠的体液免疫效应. 方法 分别用pCMV4-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ+pCMV4-C3d3联合免疫以辅助性T细胞(Th)2型优势的BALB/c小鼠和Th1型优势的C57BL/6小鼠,免疫剂量分别为5、10、50、100和500 pmol,同一剂量免疫两次、间隔3周.初次及加强免疫后每周采血,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清抗hCGβ抗体水平.硫氰酸钠洗脱法ELISA分析抗hCGβ抗血清亲和力. 结果 两种品系小鼠pCMV4-hCGβ-C3d3免疫产生抗hCGβ抗体的时间和效价均显著早(高)于pCMV4-hCGβ和联合免疫组.在50 pmol免疫剂量时,C3d3在两种品系小鼠呈现出强的佐剂活性,分别使hCGβ的免疫原性增强了400倍(BALB/c)和251倍(C57BL/6). pCMV4-hCGβ-C3d3组两个品系小鼠亲和力成熟较快. 结论 在Th2型及Th1型免疫优势的不同品系小鼠,分子佐剂C3d3均能增强hCGβ基因疫苗体液免疫效应.
关键词： 分子佐剂 C3d3 人绒毛膜促性腺激素β 基因疫苗 体液免疫 -
结核病DNA疫苗的现状与未来
1990年Wolff等[1]在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白至少2月,从而产生了核酸疫苗或基因疫苗、基因免疫、核酸免疫的全新概念,开创了免疫学和疫苗学的新领域.核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成,它被注入机体后,通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原,诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗可诱导全面的免疫反应,尤其是特异性CTL识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体,这对于清除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义.1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一.本文概述了结核病DNA疫苗研究的现状,及其在结核病预防和治疗方面需进一步研究的问题和应用前景.
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慢性病毒性肝炎的治疗现状与评价
我国慢性病毒性肝炎病人数量多,治疗难度大,既严重影响人民的身体健康,又消耗了大量的经济资源.客观地讲,目前并没有能够彻底根治慢性病毒性肝炎的特效药物.但是我国有丰富的中药资源,近年来国外新研制的抗病毒药物也愿意在中国进行早期的临床研究.另外,人们根据对病毒性肝炎免疫学发病机理的理解,一些新的免疫疗法如治疗性多肽疫苗、基因疫苗、细胞免疫治疗等也都在积极地研究中.这些都给我国的肝炎患者带来了希望.现就当前慢性病毒性肝炎,主要是慢性乙、丙型肝炎的治疗现状作一简单的评述.
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TLR9介导DNA病毒的免疫识别
Toll样受体(toll-like receptor,TLR)是免疫细胞表面的模式识别受体(patttern recognition receptor,PRR),参与微生物病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)的识别,从而诱导天然免疫应答.迄今在人类已经确定了10个TLRs家族成员[1].不同的TLRs识别不同的PAMPs,如TLR9是免疫细胞识别病毒和细菌中非甲基化DNA的必需成分[2];TLR3是识别双链RNA(dsRNA)病毒的特异性受体[3].尽管TLRs在天然识别细菌和真菌中已经显示出了重要作用,但在体内抗病毒免疫的作用还不清楚[4].通过对TLR9与病毒感染相关性研究,为探讨HIV及HPV等DNA病毒致病机理和制备其基因疫苗开辟新的思路.
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扎伊尔型埃博拉重组糖蛋白GP-Fc基因疫苗构建及免疫原性研究
本实验将基于埃博拉病毒表面糖蛋白抗原GP基因序列,按照哺乳动物密码子使用频率优化,并与人IgG恒定区构建融合蛋白GP-Fc基因序列,重组蛋白序列插入基因疫苗载体pVR中,构建重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc.通过基因疫苗导入系统免疫小鼠,用间接ELISA和间接免疫荧光对抗体效价进行评估.实验结果显示,重组蛋白GP-Fc的基因疫苗可以很好的刺激小鼠产生特异性抗体,免疫周期结束后,小鼠血清中结合效价终点达到高剂量组1∶300 000及低剂量组1∶180 000,同时血清中的抗体可以很好地结合表达GP抗原的细胞表面,表现出很强的荧光信号.通过该研究我们验证重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc可以很好地诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的抗原特异性IgG,具有较好的免疫原性.
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含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用
目的 研究含信号肽MTB8.4基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用.方法 雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即含信号肽的MTB8.4(MS)基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1+组和PBS组.ELISA检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行CTL杀伤检测.用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,观察小鼠部分肺和脾组织的病变程度;Z-N染色查结核杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用.结果 MS基因疫苗能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;免疫组小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻.结论 结核病MS基因疫苗能诱导较强的Th1型细胞免疫应答,对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护作用,但尚需进一步提高.
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丙型肝炎病毒核心基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答
为了探索丙型肝炎病毒核心区基因疫苗对小白鼠细胞及体液免疫功能的影响,本文将HCV核心区基因定向克隆于质粒pcDNA3巨细胞病毒启动子下游,构建了能在真核细胞内表达的重组基因疫苗pcDNA3-HCV,将此疫苗通过多点肌肉注射免疫BALB/C小鼠,结果发现接种了该疫苗的小鼠出现抗-HCV IgG阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时Th1免疫应答相关的细胞因子IL-2及g干扰素水平也明显高于对照组,其结果表明,HCV核心基因疫苗能诱导BACB/L小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答.
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弓形虫 SAG2和 GRA2基因疫苗的免疫保护研究
DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体，直接接种机体，在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。 pCMV-Taq2B载体具有人巨细胞病毒（ Human cytomegalovirus， CMV）高效启动子／增强子序列，可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建pCMV-Taq2B-Surface antigen 2（表面膜抗原2）（ pSAG2）、 pCMV-Taq2B-Dense granule protein 2（致密颗粒蛋白2）（pGRA2）及 pCMV-Taq2B-SAG2-GRA2（ pSAG2-GRA2） DNA 疫苗并研究其免疫保护效果。将 pSAG2、pGRA2、 pSAG2-GRA2 DNA疫苗（实验组）、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline， PBS）、 pCMV-Taq2B空质粒（对照组）分别肌肉注射BALB／c小鼠， ELISA法检测血清IgG抗体水平。末次免疫后第28 d，各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1000个，观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗pSAG2、 pGRA2和双基因疫苗pSAG2-GRA2免疫组均能诱导产生特异性IgG抗体，且于末次免疫后第28 d达到高值，此时单基因疫苗pGRA2（0.382±0.66）和双基因疫苗pSAG2-GRA2（0.548±0.137）免疫组吸光度值显著高于PBS （0.137±0.016）或pCMV-Taq2B （0.135±0.010）对照组吸光度值。免疫单基因疫苗pSAG2（14.3±1.8）、 pGRA2组（13.5±2.1）小鼠存活时间（d）明显长于PBS （4.3±1.6）及pCMV-Taq2B组（4.1±1.3），且双基因疫苗 pSAG2-GRA2组（19.6±2.4）小鼠存活时间明显长于单基因疫苗 pSAG2组及pGRA2组。弓形虫双基因疫苗pSAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，其免疫保护性优于pSAG2、 pGRA2单基因疫苗。
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巴西利什曼原虫激活蛋白激酶C受体的基因克隆化与序列分析
体外培养巴西利什曼原虫(Lb,Leishmania braziliensis)株无鞭毛体,常规方法提取制备基因组DNA.以公开发表的婴儿利什曼原虫(Li,Leishmania in fantum)的激活蛋白激酶C受体RACK(receptor for activated protein C kinase)基因核苷酸序列为参照,设计并合成利什曼原虫RACK基因序列特异性的引物.以巴西利什曼原虫的基因组DNA为模板,利用多聚酶链反应(PCR)技术,扩增获得巴西利什曼原虫RACK的全长编码基因.基因序列测定结果表明,巴西利什曼原虫RACK基因序列长度为1 025 bp,开放读码框架由939 bp组成,编码产物为312个氨基酸残基.获得的巴西利什曼原虫的RACK基因与报导的婴儿利什曼原虫的RACK基因编码产物的序列同源性达99%(310/312).本研究克隆了巴西利什曼原虫的RACK基因,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行巴西利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础.
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PML-RARα融合基因及其诱导特异性免疫应答
PML-RARα融合基因通过其转录抑制作用而诱发APL已基本得到认可,但其引发APL的机制是错综复杂的,在PML-RARα融合基因的致病过程中,必须有其他因素的共同参与才能导致APL.同时PML-RARα融合蛋白上存在着抗原性,PML-RARα多肽可诱导特异性免疫应答,为免疫治疗的研究提供了可能性.
关键词： PML-RARα 急性早幼粒细胞白血病 基因疫苗 克隆性 -
病毒预防靠病毒
异源基因转导细胞的重组病毒运载技术在各种基础与应用研究中已有几十年的历程.Darnell和同事利用重组腺病毒研究白蛋白启动子转录调控,属于早期应用实例之一[1].随着小鼠复制缺陷性反转录病毒问世,基因治疗的实验室研究进入了飞跃时期[2].该领域的研究热点为寻找各种DNA/RNA病毒载体或非病毒性载体[3-5].不久前,载体技术的思路已被引入基因疫苗的开发工作[6-10],这正是本系列综述所要涉及的主题.
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微小隐孢子虫CP23基因真核表达载体pcDNA3.0-23的构建及鉴定
目的 构建微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23.方法 提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA 3.0-23重组质粒.通过PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-23进行鉴定.结果 扩增出约340 bp的微小隐孢子虫CP23基因片段,并成功构建微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23.结论微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23的构建为微小隐孢子虫的基因疫苗研制奠定了基础.
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弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建
目的 构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4. 方法 根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamH Ⅰ和BamH Ⅰ/Xba Ⅰ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamH Ⅰ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定. 结果 PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100％.构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722 bp的SAG1基因片段和511 bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中. 结论 成功克隆了pVAX1 SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础.
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溶藻弧菌热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建溶藻弧菌热休克蛋白70(HSP70)真核表达载体pcDNA3.1. 方法 提取溶藻弧菌基因组DNA,PCR扩增HSP70基因片段,克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将HSP70基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1重组质粒,通过PCR、酶切及序列分析对HSP70基因pcDNA3.1重组质粒进行鉴定. 结果 扩增出1 914 bp的溶藻弧菌HSP70基因片段,并成功构建溶藻弧菌HSP70真核表达载体pcDNA3.1. 结论 成功构建了溶藻弧菌HSP70真核表达载体pcDNA3.1,为HSP70基因疫苗研制奠定了基础.
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构建IL-2优化的免疫球蛋白抗淋巴瘤基因疫苗
本研究构建白介素2(IL-2)基因与免疫球蛋白重链可变区(IgHV)基因共表达的基因疫苗.从淋巴瘤患者外周血获得免疫球蛋白基因IgHV片段,将其与IL-2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体中.表达载体通过脂质体转染COS细胞, 用ELISA法检测IL-2的表达.结果显示:本研究成功构建了IgHV基因与IL-2基因的融合基因表达载体.在IgHV-IL-2/ pcDNA3.0中IL-2可以获得正确表达.结论: 本研究构建的IL-2和IgHV的融合表达载体可以在COS细胞中分泌表达IL-2.
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bcr-abl基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤的影响
为了研究bcr-abl融合基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤的影响,采用pVbcr-abl 、pVbcr-abl/mIL7两种质粒分别免疫BALB/c小鼠,然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击免疫小鼠,观察疫苗对SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的影响,检验其是否具有免疫保护作用.结果表明:用基因疫苗免疫的两个实验组与两个对照组(空白对照组和空载体对照组)相比,在移植肿瘤形成时间、肿瘤表面破溃时间、肿瘤体积、荷瘤生存期等指标上均存在明显差异.pVbcr-abl/mIL7免疫小鼠组的荷瘤生存时间比pVbcr-abl免疫组相对延长. 常规病理学分析发现,对照组小鼠的移植瘤组织比较致密, 瘤细胞体积较大, 形状不规则, 而两个免疫组的肿瘤组织较为疏松, 肿瘤细胞体积相对较小, 并有大量炎性细胞浸润. 两个对照组小鼠的肝脏组织内发现有大量肿瘤转移灶, 而两个免疫组小鼠则未发现. 结论: 修回 bcr-abl 基因疫苗免疫的小鼠被诱导产生较强的特异性免疫保护力, 对 SP2/0/bcr-abl 移植瘤的体内生长有一定抑制能力.
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WT1抗原多表位与热休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗的构建、表达及免疫原性研究
本研究用基因工程方法构建一种由WT1抗原多表位与结核分枝杆菌热休克蛋白70(mHSP70)刺激表位组成的融合基因疫苗并检测其表达和病疫原性.根据文献资料,筛选WT1抗原有良好免疫原性的3个受HLA0201与1个受HLA2402限制性的细胞毒性T细胞(CTL)表位及2个辅助性T细胞(Th)表位,加入通用外源性T细胞刺激表位Pan-DR-Th(PADRE)后,以不同的间隔序列相连,蛋白酶体切割软件优化多表位构成,合成1条由732 bp组成的多表位WT1基因片段,并插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.通过PCR技术从结核分支杆菌基因组(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mHSP70)中扩增包含mHSP70刺激表位的DNA片段,亚克隆至pcDNA3.1(+),测序正确后将含有多表位的WT1基因片段亚克隆入该载体上游,构建融合基因疫苗pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426).用RT-PCR方法检测该基因在293T细胞表达,并免疫C57BL/6小鼠,酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)检测该疫苗的细胞免疫学反应.结果表明:通过蛋白酶体切割工具PAPROC及NETCHOP3.1预测,复合多表位基因工程疫苗各表位可被正确裂解,PCR和酶切鉴定结果表明,构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426)含有正确编码的融合基因片段,并在真核细胞获得了正确表达.将该基因疫苗免疫小鼠后,可诱导特异性的CTL应答.结论:成功构建含有WT1多表位与热休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗.
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MUC1-2VNTR基因免疫治疗多发性骨髓瘤荷瘤小鼠的实验研究
目的:明确粘蛋白1两串联重复区(MUC1-2VNTR)基因疫苗对多发性骨髓瘤荷瘤BALB/c小鼠的治疗效果.方法:用转染pcDNA3.1-MUC1的P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞皮下接种以建立BALB/c荷瘤小鼠模型.用含MUC1-2VNTR的重组质粒pcDNA3.1-2VNTR/myc-hisB肌肉注射免疫小鼠,采用乳酸脱氢酶法检测细胞毒性T细胞(CTL)反应活性,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性.观察小鼠的抑瘤率,肿瘤质量.结果:用重组质粒免疫BALB/c荷瘤小鼠25 d后,重组质粒组肿瘤质量明显轻于空质粒对照组(0.5605±0.2065 g vs.1.521±0.6985 g)(P＜0.01).重组质粒肌肉注射组CTL、NK细胞活性显著高于对照组;小鼠脾淋巴细胞得到增殖,与空质粒对照组比较,差异非常显著(P＜0.01).MUC 1-2VNTR基因免疫能诱发小鼠抗肿瘤作用.结论:MUC1-2VNTR基因疫苗可针对多发性骨髓瘤荷瘤BALB/c小鼠诱导产生特异性细胞及体液免疫应答,能诱发小鼠抗肿瘤效应,对多发性骨髓瘤的治疗具有潜在的应用价值.
关键词： 多发性骨髓瘤 两串联重复区基因疫苗 基因疫苗 -
稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立
为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中.脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞.收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×10 7CFU/ml.结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株.经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系.结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcrabl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础.
关键词： 慢性髓性白血病 BCR-ABL融合基因 基因疫苗 实验细胞模型
