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腺病毒转染法构建表达乙型肝炎病毒核心蛋白小鼠肝癌细胞系及其在乙肝疫苗评价中的应用
目的 构建一种可高效表达乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)核心蛋白(HBc)C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系,并以其作为靶细胞评价乙肝基因疫苗在C57BL/6小鼠体内所引起的HBc特异性细胞毒性T细胞(CTL)的活性.方法 以HBV全基因组为模板,采用PCR方法扩增HBc基因,插入AdEasy腺病毒穿梭载体,构建携带HBc蛋白的腺病毒穿梭载体AD-HBc,电转携带有腺病毒骨架质粒(Ad-Easy)的E.coli BJ5183感受态细胞,获得重组腺病毒质粒AD-CMV-HBc,经PmeⅠ线性化处理后转染HEK293细胞进行包装得到相关的重组腺病毒,再感染C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系Hepa1-6.结果 成功构建表达HBc蛋白的重组腺病毒,在体外对Hepa1-6细胞的感染率几乎为100％,并且HBc蛋白得到高效表达.以此为靶细胞用于pVAX1-HBc基因疫苗免疫C57BL/6小鼠产生的CTL活性的体外检测.结论 我们成功构建HBc蛋白表达的靶细胞系,对研究乙肝病毒核心抗原(HBcAg)所引起的细胞免疫反应及乙肝发病机理等方面有重要意义.
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埃博拉病毒新型疫苗研究进展
埃博拉病毒是一种烈性致死病原体,它能引起人类和灵长类动物高死亡率的出血热.随着人们对埃博拉病毒分子生物学及病理学特征研究的深入,各种新型疫苗的产生为埃博拉病毒的控制和治疗带来了希望.本文就三大类新型疫苗(DNA疫苗、病毒载体疫苗和病毒样颗粒疫苗)的研究现状和应用前景进行综述.
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肿瘤的联合基因治疗
1 不同目的基因之间的联合应用1.1自杀基因与免疫基因之间的联合应用将HSV-tk基因与能增强抗瘤免疫力的免疫基因联合应用可提高疗效.Chen等于结肠癌肝转移模型上,直接瘤体内注射含mIL-2基因和HSV-tk基因和HSV-tk基因的重组腺病毒后发现,单用tk基因或与mIL-2基因联合均有明显的肿瘤坏死和消退.
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GFP标记的重组腺病毒在消毒效果评价中的应用研究
目的 研究GFP标记的复制缺陷型腺病毒在消毒剂灭活病毒试验中应用的可行性.方法 采用商品化Ad-easy系统经同源重组包装GFP标记的复制缺陷型腺病毒,扩增后进行荧光计数和复制缺陷性能检测,其作为指示病毒进行病毒灭活试验.结果 腺病毒基因同源重组后转染AD-293细胞出现绿色荧光和细胞病变,成功包装出病毒颗粒,扩增后经荧光计数病毒滴度为4.20×106 gfu/ml.盲传3代后,感染Vero细胞未出现荧光和细胞病变,表明无子代病毒的产生.以有效氯含量200 mg/L消毒剂作用于腺病毒20 min后,杀灭对数值为4.10.结论 荧光标记的复制缺陷型腺病毒在含氯消毒剂对病毒杀灭能力检测评价中具有一定的可行性,更为高效和安全.
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表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验
构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果.本研究将编码PCV2-Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap.将被限制性内切酶PacⅠ线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap；以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5.病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右；一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响.RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2-Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达.以107TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强.对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础.
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HSV-2gD重组腺病毒疫苗的构建及免疫原性分析
Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)是引起生殖器疱疹(Genital herpes,GH)的主要病原体,研制有效的HSV-2疫苗是控制病毒传播的有效途径,本研究通过穿梭载体pDC316将糖蛋白D2(Glucoprotein D2,gD2)基因连接到腺病毒载体上,制备HSV-2重组腺病毒rAd-gD2,经PCR和Western blot的方法在基因和蛋白水平上鉴定正确后,分别于第0、2、4周免疫小鼠,以PBS和空白腺病毒载体(AdV)为对照,第7周取血,通过检测小鼠血清中gD2特应性IgG和中和抗体评价体液免疫应答,检测Th1/Th2型细胞因子评价细胞免疫应答.结果显示经过3次免疫,小鼠产生了高水平的gD2特应性IgG和较高水平的中和抗体,Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2明显高于对照组,Th2型细胞因子IL-4、IL 5和IL-10均高于对照组,P＜0.01,具有显著的统计学意义.本研究制备的rAd-gD2既可以刺激小鼠产生体液免疫应答,也可以产生细胞免疫应答,与预期设想一致,为未来HSV-2疫苗的研发提供了数据基础.
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HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究
从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量.发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平.将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag.在BALB/c小鼠体内分别以108PFIJ及108PFU rAdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应.由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.
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表达SIV Gag/Env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒三载体疫苗联合免疫小鼠的细胞免疫研究
获得性免疫缺陷综合征即艾滋病是人类面临的严重公共卫生威胁,目前常用的药物疗法仍存在一定的缺陷,尚不能彻底治愈AIDS并阻断HIV的传播.将治疗型疫苗用于HIV感染的治疗具有一定的发展潜力,但缺乏适宜的HIV感染动物模型阻碍了治疗型HIV疫苗的研制.SIV能够感染非人灵长动物并引起类似AIDS的猴免疫缺陷病,因而常被用作研究HIV及其疫苗的替代动物模型.为了对SIV疫苗在猴感染模型中治疗SIV感染的效果进行评价,我们分别构建了表达SIV gag和env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒疫苗,并联合使用这三种疫苗免疫小鼠,对包括不同抗原组合、不同免疫次序及间隔的免疫策略进行探索和优化.IFN-γ酶联免疫斑点和小鼠体内杀伤试验的结果显示,通过三载体疫苗联合免疫,能够在小鼠体内诱导出强度较高、持续时间较长的SIV Gag/Env特异性细胞免疫反应.并且,重复免疫后仍可以诱导较高水平的免疫反应.该结果为在SIV感染猴模型中评价多载体疫苗序贯和重复免疫治疗SIV感染的研究奠定了基础,也为治疗型HIV疫苗的研究提供了参考.
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表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析
为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3 (Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗.体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答.该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+ CD4+T细胞亚群.采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护.本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考.
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表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究
通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒.PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达.重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1:10000和1:1000.除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA.滴鼻组的免疫效果强于灌胃组.经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100%.该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果.
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含有人H5N1流感病毒NA基因的重组腺病毒候选疫苗株在小鼠体内诱发细胞免疫反应
本研究旨在构建人H5N1流感病毒NA基因的重组腺病毒候选疫苗株,并考察其在BALB/C小鼠体内的细胞免疫效果.本研究选用流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NA基因为研究对象,分别将野生型和按照人密码子优化的NA基因插入重组腺病毒载体,构建并鉴定了两种重组腺病毒rAdV-WtNA和rAdV-Mod.NA,纯化后病毒在第0周和第4周以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠两次,免疫剂量是109 TCID50/只/次,第5周时使用Elispot方法检测并比较病毒的细胞免疫效果.结果显示,所制备和纯化的两种重组病毒均可有效表达NA目的蛋白;免疫后的小鼠均可检测出明显的针对NA抗原的特异性细胞免疫反应,而且rAdV-Mod.NA组分泌IFN-γ细胞的数量显著高于rAdV-WtNA组(P=0.016).说明rAdV-Mod.NA是较好的人H5N1流感病毒候选疫苗株,值得进一步深入研究.
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去除致癌基因的EB病毒潜伏膜蛋白1的重组腺病毒的构建及其免疫效果
为进一步研究利用EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)进行免疫治疗的可行性,构建了含有去除致癌基因的EB病毒LMP1片段(LMP1△)的穿梭质粒pAdTrack-CMV-LMP1△,将它与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电转染的方法共同导入大肠杆菌BJ5183中,在宿主菌重组酶的介导下进行同源重组.通过抗性筛选,获得含有重组腺病毒基因的质粒;然后再通过脂质体将重组腺病毒质粒导入腺病毒包装细胞HEK293细胞中,在HEK293细胞E1蛋白的反式作用下,病毒被包装.将包装病毒的细胞裂解上清进行PCR鉴定证实,病毒DNA中含有目的基因的特异性片段.RT-PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶和Western blot的结果也显示,LMP1△蛋白在真核细胞得到表达.将扩增后的病毒感染HeLa细胞,测定病毒滴度为3.0×109PFU/ml.为初步探讨其免疫效果,采用肌肉注射和滴鼻的方式感染Balb/c纯系小鼠,免疫酶检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现,两种免疫途径均可诱发小鼠针对LMP1的特异性体液免疫和细胞免疫,而且Ad5作为免疫对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应.
关键词： EB病毒 重组腺病毒 EB病毒潜伏膜蛋白1△ 特异性细胞毒作用 -
含EBV-LMP2基因重组腺病毒修饰的树突状细胞疫苗体内外特异性抗瘤作用的研究
鼻咽癌(NPC)在东南亚地区,尤其在我国南方地区发病率高达40/10万～60/10万.Epstein-Barr virus(EBV)在鼻咽癌的病因学中有着十分重要的作用,在肿瘤细胞中该病毒的存在为以CTL为基础的免疫治疗提供了一个潜在靶位.
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含EB病毒核抗原1重组腺病毒的构建及其在小鼠中免疫效果研究
构建含EB病毒核抗原1(ebna1)重组腺病毒疫苗防治鼻咽癌,并为鼻咽癌疫苗的研究提供药效学资料.PCR法扩增B95-8细胞株中ebna1的C-端部分片段,EcoRⅠ和BglⅡ酶切后插入pDC316穿梭质粒,ebna1片段测序比对正确后,与腺病毒骨架质粒pBHG共转染293细胞.收集病变后细胞,通过流式细胞仪和Western blot检测EB-NA1在293细胞中的表达.电镜下观察所获得的病毒颗粒大小,TCID50法确定重组腺病毒滴度.以2×108 VP/只的rAd-ebna1免疫BALB/c小鼠.在免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内EBNA1特异性细胞免疫应答的水平变化.结果显示,经PCR扩增获得约900 bp ebna1目的片段,测序结果与标准株序列一致,质粒共转染293细胞后,细胞出现病变,获得含EB病毒核抗原1重组腺病毒(rAd-ebna1),流式细胞仪和Western blot检测结果证实,ebna1在细胞中正确转录表达,收获病毒二代滴度可达108 TCID50/mL.rAd-ebna1免疫小鼠后,能够激活EBNA1的CD4+T细胞特异性细胞免疫应答.本实验成功构建了含ebna1片段的重组腺病毒,并具激活CD4+T细胞免疫应答活性.
关键词： EBNA1(EB病毒核抗原1) 重组腺病毒 疫苗 -
BCR-ABL SH3-T79Y突变体 重组腺病毒载体的构建及促进白血病K562/G01细胞凋亡
目的 探讨构建BCR-ABL SH3-T79Y突变体(简称SH3-T79Y突变体)的重组腺病毒载体及其对白血病耐药细胞株K562/G01细胞凋亡的影响.方法 以pMig210质粒为模板,用重叠延伸PCR扩增SH3-T79Y突变体片段,将其克隆入重组腺病毒载体,通过鉴定、包装、扩增后得到含SH3-T79Y突变体的重组腺病毒.将重组腺病毒感染白血病K562/G01细胞株,测定其感染效率,瑞氏染色检查细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测BCR-ABL、CrkL磷酸化及总蛋白水平.结果 重组腺病毒载体构建成功.SH3-T79Y突变体转染K562/G01细胞株72 h效率大于80%,可见明显的凋亡小体、核聚集等凋亡现象,凋亡率为32.46%,较对照组显著增加(P<0.05);明显抑制BCR-ABL和CrkL的磷酸化水平,降低BCR-ABL总蛋白表达(P<0.05).结论 成功构建SH3-T79 Y突变体重组腺病毒载体,并证实其通过抑制BCR-ABL及底物CrkL磷酸化水平促进K562/G01细胞凋亡.
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Hyper-IL-6重组腺病毒治疗大鼠急性肝衰竭
目的 探讨重组腺病毒介导的超级白细胞介素6(Hyper-IL-6)对大鼠急性肝衰竭的治疗作用及机制.方法 80只急性肝衰竭模型大鼠随机分为:未感染组、AdO组、AdlL-6组、AdHIL-6组,分别予腹腔注射生理盐水、AdO、AdIL-6、AdHIL-6,后进行肝功能指标、肝脏病理学及肝细胞原位凋亡检测,并观察增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3在肝组织中的表达情况及大鼠14 d存活率.结果 AdHIL-6组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TB)含量及凋亡指数明显降低,而肝组织PCNA表达明显增高(P<0.01),肝组织病变减轻,caspase-3表达阳性,14 d存活率较高.结论 Hyper-IL-6对急性肝衰竭大鼠有明显的促肝细胞增殖及抗肝细胞凋亡效应,能有效改善肝功能及肝组织学状况,提高肝衰竭大鼠存活率.
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重组腺病毒载体介导报告基因经多种途径转染至大鼠肾脏
目的 研究重组腺病毒(rAV)介导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)能否转染到大鼠肾组织,以及多种途径转染的差异.方法 30只大鼠随机分成5组,经5种途径注射rAV-GFP(1013个病毒颗粒·L-1)溶液,注射后2、7和14 d,分别取各组大鼠的左肾、右肾、肝脏和肺,荧光显微镜观察,并通过计算机软件评价报告基因在肾组织中的表达情况.结果 各种注射方式均可使绿色荧光蛋白在肾中表达,注射后7 d时GFP表达达到高峰,并以腹腔和尾静脉注射方式表达强;经肾动脉注射的靶向性较其他方式好.结论 rAV载体能携带报告基因到肾组织,rAV可以用于肾疾病的基因治疗,且各种注射方式各有优缺点.
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人神经营养素-3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测
目的构建具有生物活性的人神经营养素-3(NT-3)基因重组腺病毒表达载体.方法从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的质粒.再与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-NT-3).用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-NT-3). 结果NT-3基因RT-PCR扩增产物约801 bp.Adeno-NT-3 PCR鉴定为正确重组子.RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA及Western blot检测显示,Adeno-NT-3能在其转染的293细胞表达和分泌NT-3.这种NT-3能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞. 结论应用体外连接法成功构建了人NT-3基因重组腺病毒表达载体,其表达产物具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞的活性作用.
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人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体的表达和生物学活性检测
目的 探讨人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体(Adeno-TrkC)在神经干细胞内的表达及其对神经干细胞的生物活性作用.方法 用RT-PCR检测Adeno-TrkC感染的293细胞的TrkC mRNA含量.用免疫细胞化学和Western blotting检测Adeno-TrkC感染的神经干细胞表达TrkC受体蛋白.在体外培养条件下,观察人神经营养素-3(NT-3)对感染了Adeno-TrkC的神经干细胞分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞的影响.结果 在Adeno-TrkC感染的293细胞和神经干细胞中检测到TrkC mRNA和TrkC受体蛋白,且表达产物和其配体NT-3结合后能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞,分化率达到55.2%,均高于其他对照组.结论 Adeno-TrkC能在神经干细胞内表达TrkC受体蛋白,这种TrkC受体蛋白具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用,这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础.
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BDNF基因对噪音引起的听神经元损伤的保护作用
目的有效地利用BDNF基因对噪音引起的听神经元损伤进行治疗.方法利用噪音制备豚鼠耳聋模型,在噪音损伤7d后,通过圆窗膜注入108重组腺病毒.注入Ad-BDNF病毒的为实验组,Ad-lacZ为对照组.4周后,取耳蜗组织固定切片,进行BDNF抗体免疫细胞化学染色和HE染色.结果经BDNF抗体免疫细胞化学染色可见,注入Ad-BDNF病毒的实验组中,在内耳多种细胞中可见明显的BDNF蛋白表达.同时,HE染色显示,注射Ad-BDNF的实验组中螺旋神经节细胞的数目明显多于对照组,细胞的状态也与正常动物相近,细胞质丰富且细胞核边界清晰.注射Ad-LacZ组的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞明显退变.结论腺病毒介导的BDNF基因可长期表达于内耳中,并且可在噪音引起毛细胞死亡后有效地抑制听神经元的退变.
