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人乳头瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析
为了检测HPV 58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HFV 58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt.用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况.结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒.L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6 400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体.对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应.结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考.
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密码子优化的人H5N1流感病毒HA基因在哺乳动物细胞中获得高效表达
为了提高人禽流感病毒血凝素HA的表达量,应对流感大流行疫苗的需求,按照人的偏爱密码子将H5N1(A/Anhui/1/2005)流感病毒的HA基因进行优化改造,经全基因合成后插人到真核表达载体pDC315中,构建了真核表达质粒pDC315-Mod.HA;将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pDC315-Wt.HA分别转染293T细胞,比较HA蛋白的表达量.结果表明:经间接免疫荧光实验及Western blot实验比较和鉴定,密码子优化后,HA蛋白在293T细胞中的表达水平显著提高,为流感大流行疫苗的研究打下了基础.
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HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究
从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量.发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平.将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag.在BALB/c小鼠体内分别以108PFIJ及108PFU rAdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应.由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.
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甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化
为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPWt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性.限制性酶切反应与测序表明.三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示.三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T＝25℃,t＝10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western bIot检测显示.纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合.这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性.
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腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配
为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究.首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1.将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1.用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达.通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs).用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs.结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs.
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人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究
将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒.为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高.将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体plRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2.通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础.
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人类免疫缺陷病毒1型gp140包膜蛋白三聚体在哺乳动物细胞中的高效表达及其性质鉴定
本研究目的是通过优化1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1) gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现在293T哺乳动物细胞中高效表达,并对纯化获得的gp140蛋白进行抗原性质鉴定.在本研究中选择HIV-1 B亚型NL4-3全基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性1inker、三聚体折叠序列等方法优化设计.通过HIV-1转录反式激活因子tat共转HEK293T细胞进行gp140蛋白表达,采用镍柱纯化.SDS-PAGE、Western blot、ELISA、负染电镜等结果显示目的蛋白纯度高于70％,每升培养基可获得0.5 mg gp140蛋白,并且具有良好的抗原活性,电镜下呈现三聚体结构.通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠免疫血清显示gp140蛋白能有效刺激机体产生免疫应答.本研究通过优化表达获得B亚型HIV-1 NL4-3 gp140蛋白,为HIV-1病毒包膜蛋白结构和重组疫苗研究奠定基础.
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中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究
利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV) VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性.通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jeat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至自来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性.同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力.结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用.本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助.
关键词： 中蜂囊状幼虫病毒(CSBV) VP2基因 系统进化 密码子优化 原核表达 -
昆虫细胞偏爱密码子优化的HPV16L1基因在昆虫和哺乳动物细胞中的表达
目的 获得有效表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的重组杆状病毒和腺病毒,为研究HPV的免疫保护机制提供材料. 方法 按照昆虫细胞密码子偏爱优化并合成HPV16L1基因,利用Bac-to-Bac昆虫表达系统获得表达HPV16L1基因的重组杆状病毒,利用AdEasy腺病毒载体系统获得表达HPVl6L1基因的重组腺病毒载体.通过间接免疫荧光和Western blot对HPV16L1基因表达进行鉴定,利用负染电子显微镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成.结果 获得了稳定表达HPV16L1蛋白的重组杆状病毒和重组腺病毒载体,在Sf9细胞和293细胞中可有效表达能被抗HPV16L1单克隆抗体识别的L1蛋白,分子质量单位为56 ku,在Sf9细胞中可观察到VLP的形成. 结论按照昆虫细胞密码子偏爱进行优化的HPV16L1基因,在昆虫细胞和哺乳动物细胞内均可有效表达.
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密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量
目的 通过密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量.方法 人工合成按照人的优势密码子优化的人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因,包装重组腺病毒后,与未优化的相同基因的重组腺病毒用Western Blot方法比较其表达量.结果 密码子优化的人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因,与未优化的相同基因的重组腺病毒比较,其蛋白表达量大大提高.结论 密码子优化确实提高了重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要.
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串联杂种泛素结合结构域蛋白（ThUBD）在大肠杆菌中的可溶性高效表达
目的：提高人工串联杂种泛素结合结构域蛋白（ tandem hybrid UBD， ThUBD）在大肠杆菌中的可溶性表达量，为泛素化蛋白研究提供高效特异的富集方法。方法根据大肠杆菌同义密码子相对频率（ RFSC）表对大肠杆菌的密码子进行分类，计算ThUBD密码子的相对适应度，并根据分析结果对ThUBD的密码子进行优化；诱导表达和蛋白定量检测密码子的优化结果；亲和纯化及泛素化蛋白富集研究检测密码子优化后的ThUBD－S的UbC结合能力。结果根据分析结果优化ThUBD密码子，使得适于大肠杆菌基因表达的密码子从48％增加到75％，并消除了阻碍转录翻译的密码子，其密码子适应指数（CAI）从0．63升高到0．88。密码子优化后的ThUBD其可溶性蛋白ThUBD－S的表达量增加了4倍，达到总蛋白的13．06％。同时，优化后的ThUBD－S可能具有更高的UbC的结合能力。结论 ThUBD的基因序列经过优化后，其在大肠杆菌中的表达量升高4倍左右。同时，序列优化不影响融合蛋白ThUBD在大肠杆菌中的可溶性表达和结合UbC的能力。
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密码子优化和蛋白加强免疫对SARS-CoV N基因重组质粒免疫原性的影响
目的:观察密码子优化的SARS-CoV N基因的重组质粒,以及DNA初始免疫-蛋白加强免疫方式诱导小鼠的体液免疫应答水平,探讨提高SARS-CoV DNA免疫原性的途径.方法:SARS-CoV BJ01株N基因和密码子优化N基因分别通过从病毒RNA中RT-PCR扩增和人工合成获得,并克隆至pVAX1载体.将重组质粒DNA以100 μg/只的剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,于第20天同剂量再免疫1次后,于第40天再用50 μg/只剂量的N蛋白加强免疫.每次免疫后于第10天采集血清,用ELISA检测血清中抗SARS-CoV N蛋白特异性抗体效价.同时设单纯重组质粒DNA免疫组和重组N蛋白免疫组作为对照.结果:密码子优化的N基因的重组质粒DNA免疫可诱导小鼠产生高水平体液免疫应答;而采用DNA初始免疫-N蛋白加强免疫的方式则可使抗体效价提高至少10倍.结论:密码子优化和DNA初始免疫-蛋白加强免疫这两种途径均可提高SARS-CoV N基因重组质粒DNA在小鼠中的体液免疫应答水平.
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人β-NGF在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定.方法 利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28a(+)+[rhβ-NGF],转化大肠杆菌株BL21(λDE3),获得基因工程菌;利用IPTG诱导rhβ-NGF在基因工程菌中表达并收集菌体;分离纯化包涵体蛋白,经体外复性及肠激酶切割去除前导肽后进一步通过镍柱亲和色谱获得rhβ-NGF;通过PC12细胞存活法检测rhβ-NGF的活性.结果 构建的基因工程菌能大量表达包涵体蛋白,体外稀释复性后获得的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测其纯度大于95％,Western blot检测其为目标蛋白;重组蛋白经肠激酶切割及进一步分离纯化后得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,纯度大于99％;经Western blot鉴定其为rhβ-NGF;生物学活性检测结果显示其比活性约为500000 u·mg-1.结论 通过优化设计密码子,建立重组人神经生长因子大肠杆菌表达系统,并实现其在大肠杆菌中的高水平表达.
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密码子优化的HPV16 L2E7基因在大肠杆菌中高效表达
目的 提高HPV16 L2E7融合基因在大肠杆菌中的表达水平,为中试研究提供高表达量的疫苗候选株.方法 根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对L2E7全基因进行密码子优化,将分段合成的基因分部插入到pET9a中,经酶切和测序鉴定无误后转化BL21(DE3+)中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.表达的融合蛋白进行SDS-PAGE胶和Western blot鉴定.同时还进行梯度实验分别对诱导的温度、时间和IPTG诱导时菌体浓度进行优化,并对蛋白的纯化方案进行摸索.结果 优化后的pET9aSL2E7AB在大肠杆菌中得到高效表达,诱导条件优化后的目的蛋白占全菌60%左右.结论 成功得到了具有较高表达水平的疫苗候选株.
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蛔虫过敏原ABA-1融合基因在大肠杆菌中的表达及鉴定
背景:利用蛔虫基因融合技术,可将过敏原ABA-1的主要基因进行融合.目的:利用大肠杆菌表达系统重组表达蛔虫主要过敏原ABA-1融合蛋白.方法:从Gene Bank和Protein Database中获取蛔虫主要过敏原ABA-1基因和蛋白序列,选定其中的ABA-1B1,ABA-1A2与ABA-1A1基因重组为融合基因BAA,经密码子优化后,全基因合成目的基因BAA并构建于表达载体PET-44a上,经KCM法转化入大肠杆菌JM109中进行克隆,PET-44a/BAA经NdeⅠ和PstⅠ双酶切及DNA测序正确后,转化入大肠杆菌RosettaBlueTM中,经IPTG诱导表达.表达蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,通过Western blot和氨基酸测序鉴定目的蛋白.结果与结论:大肠杆菌的融合蛋白BAA表达量约占总蛋白的40%,纯化后蛋其白纯度可达90%左右.Western Blot结果显示在相对分子质量45 000处可见一特异目的条带,氨基酸测序显示N端15个氨基酸与目的蛋白完全相同.结果证实,融合蛋白BAA在大肠杆菌中得到高效的表达.
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法桐花粉主要过敏原基因Pla a1重组表达及鉴定
目的:表达、纯化和鉴定法国梧桐花粉主要变应原基因Platanus acerifolia pollen allergen1(Pla a1).方法:首先根据文献查找并在GenBank获取法国梧桐花粉主要变应原基因序列Pla a1,利用DNAStar软件进行密码子优化;合成全基因;将Pla a1与载体pET-44a连接后转入大肠杆菌Rosetta中进行诱导并优化目的蛋白表达;利用亲和层析法纯化该外源表达蛋白;应用Western blot,利用法桐花粉过敏患者血清鉴定纯化后的目的蛋白的抗原性.结果:成功构建了pET44a-Pla a1阳性质粒;获得了法桐花粉主要变应原重组蛋白Pla a1;对该重组蛋白进行了亲和层析纯化;免疫印记法表明重组蛋白具有一定的抗原性.结论:首次利用密码子优化的方法获得融合Strep Tag Ⅱ的法桐花粉过敏原重组蛋白Pla a1,为制备高纯度变应原、重组低致敏过敏原及变应原核酸疫苗奠定基础.
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欧蓍草花粉主要过敏原Par j1的重组表达及鉴定
目的:克隆、表达和纯化欧蓍草花粉主要过敏原Par j 1.方法:根据Par j 1.0102在GenBank中的序列号获得其核苷酸和氨基酸序列,确定开放阅读框,采用DNAstar软件优化密码子,合成全基因,并克隆到表达载体pET-44a中,转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化蛋白表达条件并进行亲和层析纯化和Western blot鉴定.结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pET-44a+/Par j 1.0102原核表达质粒.对表达菌表达条件进行优化,终确定在30℃,IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4小时时蛋白表达量高,重组蛋白经亲和层析纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在23 kD处有明显的条带.Western blot表明重组蛋白具有与StrepII标签抗体结合活性.结论:国内首次获得融合StrepII标签的Par j 1.0102重组蛋白,为欧蓍草花粉过敏诊断及特异性免疫治疗奠定基础.
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狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白密码子优化、原核表达及多克隆抗体的制备
目的 对狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白(matrix protein,MP)密码子进行优化,原核表达重组蛋白,并制备多克隆抗体.方法 通过GenBank查找狂犬病病毒CTN-1株M蛋白编码序列并体外合成,将目的 序列插入原核表达载体pET-28b,构建重组质粒pET-28b-M,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白,经亲和层析和复性后,免疫豚鼠制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA检测多抗的免疫反应性以及效价.结果 成功构建了pET-28b-M重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,经亲和层析及透析获得纯化的重组M蛋白,制备的多克隆抗体可与M蛋白发生特异性结合,效价达1∶21 870.结论 成功优化表达了狂犬病病毒CTN-1株M蛋白,制备了高效价的多克隆抗体,为后续M蛋白生物学分析以及新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础.
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人胱抑素C的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的 构建人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)基因原核表达质粒,表达并纯化带有硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的Trx-Cys C融合蛋白,并制备抗人Trx-Cys C多克隆抗体.方法 在不改变氨基酸序列的前提下,对Cys C的全长编码基因进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化后,人工合成其序列,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+ )-Cys C,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG低温诱导表达.表达的融合蛋白经Ni-Sepharose 6FF纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗人Cys C 多克隆抗体,采用间接ELISA及Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确,获得的经同义密码子优化后的序列与预期一致；重组Cys C蛋白获得了可溶性表达,相对分子质量约为35 000,表达量约占菌体总蛋白的50％；纯化的重组蛋白纯度达90％以上,可被Cys C临床检测试剂盒所识别.制备的抗人Cys C多克隆抗体效价达1∶(5.12× 106)以上,并能特异性识别市售Cys C蛋白.结论 已成功原核表达并纯化了可溶性重组Cys C蛋白,并制备了高效价的抗人Cys C多克隆抗体,为进一步建立Cys C免疫学检测方法奠定了基础.
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密码子优化对DNA疫苗免疫原性的影响
DNA疫苗作为疫苗研制工业中的新成果已经得到了越来越多得关注.为了提高其免疫原性,发挥它大的保护作用,人们进行了各种尝试.近几年来的研究表明,通过密码子优化的方式可以提高DNA疫苗的免疫原性,增强其免疫保护作用.本文即针对该问题做了一些总结.
