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EBV-LMP2基因密码子优化对其蛋白表达及免疫效果的影响
为了研究对EBV-LMP2基因按照真核密码子偏好进行密码子优化后,对其在真核细胞蛋白表达水平以及引发细胞免疫能力的影响,我们对EBV-LMP2基因进行了完全改造,并构建了改造前后的Psectag/LMP2重组质粒,通过瞬时转染COS-7细胞检测其蛋白表达并进行了小鼠的DNA疫苗实验.结果表明,改造后的LMP2基因在真核细胞中的表达未见大幅提高,同时引发细胞免疫的能力也没有明显上升.结果提示,我们单纯按照密码子的偏好来改造基因并不一定能使蛋白的表达量和引发免疫反应的能力提高.
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密码子优化及其在DNA疫苗中应用的研究进展
近年来,DNA疫苗已在寄生虫病、结核病、艾滋病、肿瘤等领域进行了广泛的研究,但其保护作用常常并不理想.不同物种在密码子使用上的偏性导致外源抗原基冈在不同宿主中不能有效表达,这可能是影响DNA疫苗效能的主要凶素之一.已证实密码子优化后能显著增加蛋白的表达量,提高疫苗的保护率.该文就密码子偏性、密码子优化以及其在疟疾、艾滋病等DNA疫苗中的应用研究进展作一介绍.
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日本血吸虫TPI DNA疫苗基因密码子优化增强免疫保护作用的研究
目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶基因(TPI基因)密码子优化后的DNA疫苗增强免疫保护作用的效果. 方法60只BALB/c雌性小鼠随机均分为A(pcDNA3.1空质粒对照组)、B(pcDNA3.1-TPI组)、C(pcDNA3.1-TPI-mHSP70组)、D(pcDNA3.1-TPI.opt组)、E(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70组)等5组.每鼠肌肉注射相应的纯化质粒DNA 100 μg,每隔3周免疫1次,共3次.末次免疫后4周,每鼠经腹部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条,42 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2 d及感染前2 d经尾静脉采血,检测IgG及IgG1、IgG2a的水平.攻击感染前2 d取脾脏,制备单个脾细胞,用流式细胞仪检测白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-5、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)的水平. 结果 B、C、D、E组小鼠血清均检测到特异性IgG及IgG1与IgG1抗体,IgG2a/IgG1的比值分别为1.73、2.06、2.44、3.09.D、E组的IL-2、IFN-γ、TNF含量较B、C组均有不同程度地升高.D、E组减虫率分别为36.03%、39.03%,减卵率分别为41.71%、46.85%,均显著高于B、C组(P<0.01).结论 TPI基因密码子优化后的DNA疫苗相对于未优化TPI DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较强的,及以Th1为主的免疫应答.
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密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响
目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性.方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列,在不改变其氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了密码子优化的基因,并将该基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt).用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达.采用肌肉注射法,以opt、adr及pSW3891,分别对BALB/c小鼠进行免疫.用EIJSA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度,ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞.结果:opl和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型.opt免疫组小鼠特异性抗体滴度和免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ脾细胞数量都要显著的高于adr免疫组小鼠.结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒DNA疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫原性.
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十二指肠钩虫ASP-2基因密码子优化及在大肠杆菌中高效表达
目的:获得十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)分泌蛋白2(mAd-ASP-2)编码基因,构建其高效表达的大肠杆菌表达体系.方法:以RT-PCR的方法得到克隆了编码mAd-ASP-2的成熟肽全基因序列,克隆入原核表达载体pET-22b(+)中,组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2.利用大肠杆菌偏爱密码子和GenScript rare codon analysis软件获得优化密码子优化的mAd-ASP-2*基因序列并人工合成该基因,将其克隆入原核表达载体pET-22b(+),组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2*.将这2个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami-2(DE3)中,经IPTG诱导表达.结果:同样条件下,密码子优化的mAd-ASP-2*基因比优化前能够获得较高的表达,且以可溶形式存在.利用His Trap HP亲和柱获得了纯化的重组蛋白mAd-ASP-2*,确定了纯化重组蛋白咪唑洗脱液佳浓度为200 mmol/L.Western blot分析结果进一步显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白.结论:通过密码子优化实现了十二指肠钩虫ASP-2的高效表达,为进一步研究Ad-ASP-2的功能和以其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础.
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狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化
目的 有效检测狂犬病毒抗原.方法 本研究利用生物信息学软件对狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区进行分析,采用密码子优化策略将该序列的大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子.将优化的序列合成与表达载体pET-28a(+) 分别双酶切、胶回收后连接并转化至Rosetta(DE3) 菌株.挑选阳性重组表达菌经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定.同时对佳表达条件进行了研究,重组菌在30℃、IPTG终浓度为0.6 mmol/L、诱导表达6 h时重组蛋白的表达量达到大值.结果 狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区通过密码子优化后能够在大肠杆菌中成功表达,表达产物具有良好的反应原性.结论 该项研究为后续检测狂犬病毒抗原的ELISA试剂盒的研发建立基础.
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绿色荧光蛋白在寄生虫学研究中的应用
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于水母、水螅等腔肠动物体内的生物发光蛋白质,由238个氨基酸组成,分子量为27kDa[1].关于GFP的结构近年来有许多报道[2-3],它是由11个β-折叠围绕着一个α-螺旋而成的圆桶状结构,α-螺旋含有一个3肽(Ser-Tyr-Gly)环化而成的发光基团[4].通过对发光基团和其它区域进行随机诱变,已经得到许多GFP突变体,有的发蓝光,有的发出的荧光比野生型强[5].通过对GFP基因进行密码子优化,得到了能在不同生物高效表达的突变体,如病毒、细菌、寄生虫、酵母、昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞等.
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HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达
目的 构建含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白.方法 PCR扩增,获得HIV-1 C亚型gp120片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd-gp120,PacⅠ酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd-gp120.结果 经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd-gp120重组腺病毒;通过Western 印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120 kD的蛋白.结论 成功构建了含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达.
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大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建
目的：构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子（BDNF），探讨其原核表达BDNF的可行性。方法：大鼠BDNF进行密码子优化，人工合成BDNF的全基因序列，经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中，将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达后，利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果：PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确，BDNF基因的克隆和表达载体构建成功，IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测，其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论：经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体，具有一定的生物活性。
关键词： 大鼠脑源性神经营养因子 密码子优化 表达载体构建 ELISA检测 -
植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成
目的 以重叠PCR方法 合成植物偏爱密码子优化后的人乳头瘤病毒18L1全长基因.方法 自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列,经生物信息学分析后选定目标序列,经Synthetic Gene Designer及JCat(Java Codon Adaptation Tool)分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子,在C端加入蛋白纯化标签His-tag,获得改造后的HPV18L1全长序列(mHPV18L1).结合酶切位点分析将mHPV18L1设计为204~477 bp的五个大片段LS1-LS5,再将每个大片段分割成57~59 bp的 5~11个寡聚核苷酸短链,设计合成5对内引物和1对外引物,经重叠PCR扩增获得mHPV18L1全长基因,纯化后将其克隆入pMD18T载体,酶切、测序鉴定插入子.结果 以重叠PCR成功扩增获得mHPV18L1全长,pMD18T-mHPV18L1重组质粒经酶切、PCR鉴定均得到预期1749 bp大小的片段,并经测序验证.结论 获得以植物偏爱密码子进行序列优化的mHPV18L1全长基因及其重组质粒pMD18T-mHPV18L1,为后续mHPV18L1的植物转化研究奠定了一定的工作基础.
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重叠延伸PCR合成风疹病毒E1蛋白抗原肽基因及其表达
[目的]利用重叠延伸PCR合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础.[方法]利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化；设计多对寡核苷酸引物,以重叠延伸PCR法合成相应抗原肽段,克隆后测序鉴定.再以酶切连接的方法将合成的抗原肽序列克隆导入原核表达载体pET32a；利用IPTG诱导抗原肽段的表达,SDS-PAGE和Western blot法分析表达产物.[结果]经过6轮重叠延伸PCR扩增,成功获得与预期目的序列一致的风疹病毒E1基因抗原肽并构建获得重组质粒pET32-rE1；在37℃下分别以终浓度为1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导抗原肽表达,SDSPAGE和Western blot法检测到预期的蛋白条带；且以IPTG 终浓度为1 mmol/L诱导6h后表达量高.[结论]成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因抗原肽段,构建其原核表达载体pET32-rE1并表达该抗原肽.
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密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染
目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.
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优化密码子提高草原兔尾鼠ZP3融合蛋白的原核表达
目的: 探讨提高草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)卵透明带3 (LZP3)基因在原核细胞中表达的水平.方法: 利用重叠PCR技术, 定点突变LZP3基因上3个稀有的密码子簇, 将LZP3基因中7个稀有的密码子更换成大肠杆菌(E.coli)常用的相应密码子.将获得的LZP3突变基因(LZP3m)插入pGEX4T-1中, 构建重组表达载体.以重组体转化E.coli BL21(DE3)菌株进行表达.结果: LZP3m基因的表达量比野生型LZP3基因明显提高.结论: 通过密码子优化, 能显著提高LZP3基因在原核细胞中的表达水平.
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重组凝乳酶原基因的原核表达及其抗血清的制备
目的:原核细胞表达密码子优化的凝乳酶原并制备抗血清.方法:以大肠杆菌密码子的偏爱性整合牛、羊和骆驼的凝乳酶原(pCHY)序列后分别克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-30a和真核高效抗体制备核酸疫苗载体pcDNA3-AAT-COMP-C3d3( pcD-ACC)上.原核表达质粒pET30a-pCHY转入大肠杆菌后经IPTG的诱导得到高表达的凝乳酶原,作为检测抗原.真核表达质粒pcDNA3-AAT-COMP-pCHY-C3d3(pACCC)用水动力转染法验证其在mRNA水平的表达后,采用DNA prime-protein boost的策略免疫新西兰大白兔后制备抗体并检测其特异性和效价.结果:SDS-PAGE和Western blot检测表明,成功表达出与预期相对分子质量大小相符的重组凝乳酶原；ELISA检测表明获得高效价的凝乳酶原抗血清.结论:通过密码子优化及核酸疫苗载体pcD-ACC联合DNAprime-protein boost的免疫策略可制备高表达量的重组凝乳酶原,得到接近于蛋白免疫水平的高滴度抗体.
