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细胞因子GM-CSF对犬透明带3 DNA疫苗免疫小鼠抗生育效果的研究
目的 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)作为免疫佐剂,能够影响犬透明带3(CZP3) DNA疫苗的免疫效果,有助于研制有效降低流浪犬生育的犬透明带3 DNA疫苗.方法 采用RT-PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析GM-CSF对小鼠肌肉注射部位的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)成熟和富集的影响.然后通过电脉冲刺激小鼠肌肉,将分子佐剂pcDNA3-GM-CSF与DNA疫苗pcDNA3-CZP3单独或联合免疫接种雌性BALB/c小鼠.ELISA方法检测了小鼠血清和生殖道中抗体IgG和sIgA(secretary IgA)的水平以及血清中IL-4和IFN-γ的含量,MTT方法检测小鼠脾脏T细胞的增殖,间接免疫荧光验证血清中CZP3抗体与小鼠卵细胞结合的能力,抗生育实验分析免疫不育效果.结果 GM-CSF与pcDNA3-CZP3共免疫小鼠能够显著促进CD80、CD83和CD86的表达,促进pcDNA3-CZP3免疫接种小鼠血清中IgG和生殖道中sIgA抗体水平的显著升高(P<0.01).免疫小鼠的IL-4和IFN-γ的含量均显著增加(P<0.05),MTT法证明脾脏T细胞增殖显著(P<0.05),间接免疫荧光结果表明小鼠卵细胞表面的荧光强度和致密度与免疫组血清中抗体的水平成正相关,抗生育实验表明GM-CSF显著性(P<0.05)地降低DNA疫苗pcDNA3-CZP3免疫小鼠的产仔数目.结论 GM-CSF作为免疫佐剂能够显著增强犬透明带3 DNA疫苗的免疫不育效果,可以作为增强犬透明带3 DNA免疫不孕疫苗的有效佐剂.
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结合ZP3的精子表面蛋白的研究进展
哺乳动物精子表面蛋白大多为糖蛋白,它和卵透明带ZP3的识别结合是多位点结合,具有特异性.半乳糖苷转移酶-1仅长链型由精子细胞合成,并且只与卵透明带中的ZP3识别结合,可能凭借其胞内的特殊结构活化G蛋白诱导顶体反应.精子表面黏附蛋白P68被证明为芳香基硫酸酯酶-A,也是ZP3的受体蛋白,在精子穿透卵透明带中发挥重要功能.
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草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究
目的:构建草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3进行小鼠的黏膜免疫,增强该疫苗的免疫不育效果.方法:将两种佐剂分子大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基和C3d基因通过酶切鉴定,构建重组质粒pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3 d3,采用RT-PCR和Western blot技术,检测其在mRNA和蛋白水平的表达,并通过肌肉注射、滴鼻和灌服3种途径免疫雌性C57BL/6小鼠,通过ELISA检测抗体水平及分型.结果:酶切鉴定,RT-PCR和Western blot 结果表明重组质粒构建正确并可在mRNA和蛋白水平的表达,ELISA结果表明以重组质粒pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3免疫诱导的特异性IgG、IgA的水平明显高于对照组(P＜0.01)o抗生育实验表明该疫苗免疫的小鼠平均生仔数与对照组相比差异极显著(P＜0.01).结论:构建的草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗重组质粒pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3可高效地激发小鼠特异性免疫应答,提高抗生育的效果.
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草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达
目的:探索制备免疫不育疫苗的新途径, 获得草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)重组腺病毒减毒活疫苗.方法:将LZP3基因亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上, 采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带LZP3基因的重组腺病毒载体.获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞, 包装成病毒颗粒.PCR鉴定重组腺病毒, 继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞, 并以RT-PCR、 Western blot检测LZP3的转录和表达.结果:成功构建了携带LZP3基因的重组腺病毒pAd-LZP3载体, 其转染293细胞后包装出重组病毒, PCR证实LZP3基因已整合至腺病毒基因组中, 病毒的滴度可达1.2×1010 pfu/L.RT-PCR和Western blot检测表明RAd-LZP3感染的HeLa细胞中LZP3基因能够有效转录和表达.结论:制备的RAd-LZP3可成功表达LZP3基因, 为后续开展RAd-LZP3免疫动物的研究奠定了基础.
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优化密码子提高草原兔尾鼠ZP3融合蛋白的原核表达
目的: 探讨提高草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)卵透明带3 (LZP3)基因在原核细胞中表达的水平.方法: 利用重叠PCR技术, 定点突变LZP3基因上3个稀有的密码子簇, 将LZP3基因中7个稀有的密码子更换成大肠杆菌(E.coli)常用的相应密码子.将获得的LZP3突变基因(LZP3m)插入pGEX4T-1中, 构建重组表达载体.以重组体转化E.coli BL21(DE3)菌株进行表达.结果: LZP3m基因的表达量比野生型LZP3基因明显提高.结论: 通过密码子优化, 能显著提高LZP3基因在原核细胞中的表达水平.
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草原兔尾鼠GST-LZP3融合蛋白的原核表达及其抗体制备
目的:在原核中表达并纯化草原兔尾鼠卯透明带3(zona pel-lucida3,ZP3),并以其作为抗原,制备抗ZP3的抗血清.方法:将LZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中.经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并经丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-LZP3融合蛋白.以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清.抗血清的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测.结果:成功地构建GST-LZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST-LZP3融合蛋白.以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-LZP3融合蛋白的高效价抗血清.结论:获得原核表达的GST-LZP3融合蛋白并制备了兔抗LZP3的抗血清,为采用免疫不育技术进行草原兔尾鼠生育控制的研究提供了重要的制剂.
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草原兔尾鼠卵透明带3(ZP3)cDNA保守序列的克隆与序列分析
根据Gene Bank数据库中5种啮齿目动物卵透明带3(ZP3)cDNA的序列,利用DNAMAN和NIH NCBI BLAST同源性分析程序设计了特异性引物.从6周龄的未孕雌性的草原兔尾鼠卵巢中用柱离心法得到总RNA,利用反转录技术得到cDNA,通过特异性引物进行PCR扩增草原兔尾鼠的ZP3cDNA保守序列.将扩增产物连接到pMD18-T载体上,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆,酶切鉴定后进行测序.将其与Gene Bank中啮齿目动物ZP3 cDNA进行同源性比较,获得了草原兔尾鼠ZP3cDNA的保守基因序列,与啮齿类同类基因比较,具有较高的同源性.
