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显性负突变存活素质粒的构建
目的 构建显性负突变存活素质粒.方法 从大鼠心脏微血管内皮细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,利用巢式PCR扩增存活索基因全序列,并引入酶切位点,利用重叠PCR对存活素基因进行定点突变,然后与带绿色荧光的真核表达载体pEGFP-N3进行重组,经测序鉴定后转染细胞,观察对细胞凋亡的影响.结果 用巢式PCR扩增出含存活素基因的496 bp产物,和引入酶切位点后452 bp产物.通过重叠PCR 3次PCR反应,得到452 bp大小的定点突变产物.重组载体经测序鉴定表明插入片段无误,转染细胞后能发出明亮的绿色荧光,Hochest染色显示细胞凋亡比空质粒对照组显著.结论 成功构建了显性负突变存活素质粒.
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霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达
目的 构建霍乱毒素A亚基基因(ctxA)和B亚基基因(ctxB)的融合表达载体,并在原核系统表达,为霍乱毒素(CT)免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础. 方法 以霍乱弧菌DNA为模板,利用重叠PCR技术,扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB,并与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3).经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达TrxBB-CTAB融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定. 结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了霍乱弧菌1 158 bp的ctxAB融合基因,成功构建了重组质粒pET-ctxAB,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达. 结论 霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起,融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达.
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A型肉毒毒素多表位串联体的设计、表达、纯化及鉴定
目的:设计、表达两个A型肉毒毒素多表位串联体.方法:从文献报道的A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)的表位及生物信息学方法预测得到的B细胞表位中遴选表位,并加入适当的辅助性元件,设计多表位串联体A、B.对其基因进行优化后,经重叠PCR方法合成串联体A、B的全长基因.分别插入原核表达载体pQE-30,再转化E.coli M15[pREP4]感受态细胞中进行诱导表达,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,并进行鉴定.结果与结论:成功设计并构建了两个多表位串联体A、B,并在E.coli中以包涵体形式获得高效表达.Ni-NTA法纯化后分别获得纯度大于92.2%、99%的重组串联体A、B蛋白,并经透析复性法复性.Western印迹和间接ELISA显示纯化、复性后的重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清有特异性结合反应.
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戊型肝炎病毒多拷贝分泌表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达
目的:将胞内表达载体pAO815改建成分泌型表达载体,并体外构建戊型肝炎病毒ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,进一步比较不同转化子在毕赤酵母中的表达水平,以得到高表达重组菌株.方法:利用重叠PCR技术将α-factor信号肽基因与目的基因ORF2128-660拼接后插入去磷酸化的pAO815载体,得到分泌型表达重组质粒α-ORF2128-660/pAO815(单拷贝),然后将BamH Ⅰ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-α-ORF2128-660)插入到去磷酸化的重组质粒α-ORF2128-660/pAO815中,得到2(AOX-α-ORF2128-660)/pAO815(2拷贝),电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导,SDS-PAGE分析不同拷贝数转化子的表达产量,ELISA检测表达产物的生物活性.结果:α-factor信号肽基因与目的基因ORF2128-660已克隆入表达载体中,目的蛋白分泌至诱导液上清中,相对分子质量约为59 000,与阴性对照比,单拷贝、2拷贝转化子表达的产物均有生物活性但表达水平无区别.结论:成功改建成分泌型表达载体,构建了多拷贝重组表达质粒,并且成功表达了目的蛋白,为利用改造的pAO815载体表达其他蛋白奠定了基础.
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Flag和GFP双标记的BKCa通道α亚基表达质粒的构建、鉴定和序列分析
目的:采用重叠PCR法构建表达质粒,为下一步研究通道功能奠定基础.方法:在已有编码大电导钙激活钾通道(BKCa)通道α亚单位的表达质粒pcDNA3.1-hSlo的基础上,采用重叠PCR法构建Flag和GFP双标签标记的表达质粒pcDNA3.1-Flag-hSlo-GFP(Flag-hSlo-GFP).结果:构建的表达质粒Fag标签插入BKCa通道的S1-S2胞外环,GFP标签连接BKCa通道的胞内C末端,测序结果证实质粒构建成功.结论:成功构建BK通道基因表达质粒Flag-hSlo-GFP,重叠PCR能够很好的用于长片段基因扩增和插入片段的实验.
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重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用
目的 应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E. coli BL21(DE3)中表达.方法 设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b(+),构建重组质粒pET-PsodAP,转化E. coli BL21(DE3)进行表达.用SDSPAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的 蛋白表达量.结果 启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800 bp的目的 条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的 蛋白在E. coil BL21(DE3)中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%.结论 应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E. coli BL21(DE3)中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础.
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百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达
目的 构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法 根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成-个新的基因序列S1'.将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1',转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 S1'基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建止确;表达蛋白的相对分子质量约17 400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础.
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替换稀有密码子提高HBsAg在CHO细胞中的表达量
目的通过替换S基因稀有密码子,提高HBsAg在CHO细胞中的表达量.方法利用重叠PCR技术,将S基因上3个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子,得到Sm基因.把S和Sm基因分别克隆到pCI载体上,并转染CHO(dhfr)细胞,利用ELISA方法检测HBsAg的表达量.结果获得预期的Sm基因.在CHO细胞中,Sm基因表达量明显高于S基因.结论替换S基因稀有密码子可以提高HBsAg的表达量.
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EB病毒潜伏膜蛋白2A抗原表位的融合表达及其意义
为了探讨含有EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)抗原表位片断表达的融合蛋白在鼻咽癌血清学检测中的应用意义,通过重叠延伸PCR方法,合成了3对相互重叠的寡核苷酸引物,涵盖LMP2A的主要的4个抗原表位,将它们拼接在一起构建一个多肽融合基因,克隆到PGEX-4T-2载体中表达融合蛋白,以GST亲和层析柱法纯化融合蛋白,鉴定后以此为抗原检测鼻咽癌患者的血清.结果表明,获得了含EB病毒LMP2A主要的4个抗原表位的融合蛋白(EC2A),蛋白纯度达90%以上,ELISA结果显示鼻咽癌患者血清的检出率为77.9%,正常人群血清为阴性,与常规的VCA-IgA法进行比较,有9份(13.3%)血清VCA-IgA为阴性而EC2A-IgG检出阳性,为鼻咽癌的临床检测提供了新思路,也为后续的单克隆抗体制备奠定了基础.
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日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因合成、表达与免疫原性研究
目的 合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因,并研究其免疫原性.方法 采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD(aa107～aa182)完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化大肠埃希菌BL21(DE3),获得含重组表达质粒的转化子,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察TSP2HD融合蛋白表达情况.用谷胱甘肽(GST)融合蛋白纯化胶(glutathione sepharose 4B)从表达产物裂解上清中纯化GST-TSP2HD融合蛋白,用凝血酶切割融合蛋白,制备纯化的重组TSP2HD蛋白.通过蛋白质印迹(Western blotting)分析重组TSP2HD蛋白与血吸虫病患者血清及血吸虫重感染兔血清的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白刺激血吸虫感染小鼠淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,通过比较实验组与对照组脉冲指数(cpm)值的差异研究重组TSP2HD蛋白的免疫原性.结果经过3轮重叠PCR扩增,获得长228 bp的TSP2HD基因,序列分析证实与天然基因序列完全一致.含重组质粒TSP2HD-PG的转化子细菌,经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为34000的可溶性GST-TSP2HD融合蛋白.凝血酶切割GST-TSP2HD融合蛋白获得纯化的重组TSP2HD蛋白.Western blotting分析证明,重组表达蛋白可被血吸虫重感染兔血清和血吸虫病患者血清识别,有较好的免疫反应性:重组TSP2HD蛋白能刺激血吸虫感染小鼠脾细胞增殖,实验组cpm值明显高于对照组,两者间差异有统计学意义(P<0.01).结论 日本血吸虫TSP2HD基因合成及表达获得成功,重组TSP2HD蛋白有天然免疫原性.
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EGFR基因G719 S和T790 M突变载体的构建及临床应用研究
目的 构建与宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因G719S和T790M位点突变型重组载体,利用其建立分子开关平台检测宫颈癌EGFR基因突变.方法 以野生型重组质粒为模板,利用重叠PCR技术,得到突变型融合目的DNA片段,再将此目的片段连接入pMD19-T质粒中,构建成突变型重组载体,将其转化入大肠埃希菌E.coli DH5α感受态细胞进行表达,用菌液PCR和基因组测序进行鉴定.设计特异性检测引物,建立分子开关检测平台用于临床宫颈癌样本的检测.结果 通过基因组测序证实G719S和T790M突变位点成功引入,定点突变载体构建成功.成功建立了分子开关检测平台用于宫颈癌组织DNA的检测.结论 利用重叠PCR技术简便、高效地构建了EGFR基因突变重组载体,并建立了分子开关检测平台,为基因定点突变及临床上检测EGFR基因突变提供了新的技术手段.
关键词： 宫颈癌 表皮生长因子受体基因 定点突变 重叠PCR -
重叠PCR法构建宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M融合重组载体
目的 构建包含与宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M位点重组pMD19-exon18-exon20载体,为制备突变型EGFR基因重组载体提供模板.方法 以健康人全血基因组DNA作为模板,设计2对有重叠互补区的特异性引物,对EGFR基因的exon 18和exon20两片段分别进行扩增,用重叠PCR技术将exon 18和exon20片段进行连接,再将连接产物exon1 8-exon20片段插入pMD19-T质粒,构建成野生型pMD19-exon1 8-exon20载体,转入至大肠埃希菌感受态细胞DH5α中进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定.结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示,exon18和exon20两位点扩增片段在778 bp和596 bp处有清晰的目的条带,两片段的融合产物exon1 8-exon20片段可在1 374 bp处见一清晰目的条带;经菌液PCR和基因组测序结果鉴定,EGFR基因融合重组质粒均与预期结果一致.结论 利用重叠PCR法将exon 18和exon20片段进行融合,且成功构建了EGFR基因重组表达载体.
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重叠PCR法构建PTEM基因3位点的融合重组载体
目的 构建包含与子宫内膜癌相关的PTEN基因3位点的重组pMD19-exon 5-exon 8载体.方法 以健康人全基因组DNA为模板,设计2对有重叠区的特异性引物分别扩增PTEN基因的exon 5和exon 8片段,利用重叠PCR技术,将exon 5和exon 8片段进行连接,再将连接产物exon 5-exon 8片段插入pMD19-T质粒,构建成重组pMD19-exon 5-exon 8载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定.结果 exon 5-exon 8片段经凝胶电泳检测,可在1 253 bp处见一清晰的目的条带,PTEN基因融合重组质粒经菌液PCR及测序结果鉴定,均与预期结果一致.结论 应用重叠PCR法将exon 5和exon 8片段进行融合,并成功构建了PTEN基因融合重组表达载体.
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人YAP1基因亚型的质粒构建及表达鉴定
目的:构建人Yes相关蛋白1(YAP1)基因亚型1δ、2δ的真核表达载体并进行瞬时表达鉴定,为研究YAP1亚型间的区别及其在肿瘤中的作用打下基础.方法:在已有pCI2-Flag-YAP1-2γ质粒的基础上,利用重叠PCR增加碱基的方法得到YAP1-2δ的片段,再同理删减WW基因序列得到YAP1-1δ片段,通过Cla I和Sal I两个酶切位点将片段和pCI2载体相连接,构建pCI2-Flag-YAP1-1δ及pCI2-Flag-YAP1-2δ质粒.利用测序确认完整的DNA序列.在HEK293细胞中瞬时转染质粒,用Western blot方法检测YAP1两个亚型的蛋白表达.结果:重组质粒经双酶切和基因测序比对鉴定正确,HEK293细胞经瞬时转染表达出YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白.结论:成功构建了pCI2-Flag-YAP1-1δ及pCI2-Flag-YAP1-2δ真核表达质粒,并在HEK293细胞内过表达成功.为进一步探讨YAP1各亚型对肿瘤发展的影响奠定基础.
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利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究
目的 利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组.方法 将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5'端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3'端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果.结果 重叠PCR技术得到全长为3 200 bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果 证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中.结论 成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的 基因功能研究奠定了基础.
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将串联亲和纯化标签敲入耻垢分枝杆菌基因组的方法研究
目的 利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将串取亲和纯化(TAP)标签敲入耻垢分枝杆菌基因组.方法 从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5'端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3'端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成终的敲入片段A5THA3;将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果.结果 PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中.结论 成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的 基因功能研究奠定了基础.
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对虾抗菌肽PEN-3和PEN-4嵌合基因在大肠杆菌中的表达及抗菌活性测定
目的 表达融合2种具有对虾抗菌肽活性的新型抗菌肽.方法 利用overlap-PCR连接并扩增对虾抗菌肽Penaeidin-3和Penaeidin-4的嵌合基因序列,定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建此嵌合基因的表达质粒.将表达质粒转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度1.0 mmol/L IPTG分别在37℃和15℃诱导表达4 h和14 h,SDS-PAGE分析嵌合蛋白质的表达,用抑菌圈法测定产物的抑菌活性.结果 获得了含有Penaeidin-3和Penaeidin-4嵌合基因的表达质粒;18%SDS-PAGE电泳显示,大肠杆菌中表达的嵌合蛋白质相对分子质量约14.7×103,主要以包涵体形式存在,包涵体15℃的表达量高于37℃的表达量;包涵体复性后,对枯草杆菌和溶藻弧菌具有明显的抑菌活性.结论 实现了2种对虾抗菌肽嵌合基因在大肠杆菌中的表达.
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双亚基共表达重组人白细胞介素12真核质粒pEGFP-C1_IL-12的构建及表达
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人白细胞介素12双亚基目的基因(hIL-12,P35、P40)的真核表达质粒pEGFP-C1_IL-12,为进一步研究基因的定位、表达及hIL-12的抗肿瘤作用奠定基础.方法 提取脂多糖(LPS)诱导后的人脐带血淋巴细胞总RNA,RT-PCR法扩增人白细胞介素12的双亚基P35和P40的全长cDNA,采用重叠PCR法连接两个亚基,双酶切双亚基片段及载体pEGFP-C1,T4 DNA连接酶连接,重组质粒转化大肠埃希菌,挑取阳性克隆,PCR、双酶切及测序鉴定证实质粒构建成功.借助脂质体将重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过荧光显微镜检测报告基因的表达,RT-PCR及Western blot法检测目的基因的表达.结果 PCR及测序鉴定证实重组质粒pEGFP-C1_IL-12构建成功,RT-PCR及Western blot法证实重组质粒在HepG2细胞内正常表达.结论 携带报告基因(GFP)和双亚基目的基因(hIL-12,P35、P40)的重组真核质粒pEGFP-C1_IL-12构建成功,并能在人肝癌细胞系HepG2中表达.
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植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成
目的 以重叠PCR方法 合成植物偏爱密码子优化后的人乳头瘤病毒18L1全长基因.方法 自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列,经生物信息学分析后选定目标序列,经Synthetic Gene Designer及JCat(Java Codon Adaptation Tool)分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子,在C端加入蛋白纯化标签His-tag,获得改造后的HPV18L1全长序列(mHPV18L1).结合酶切位点分析将mHPV18L1设计为204~477 bp的五个大片段LS1-LS5,再将每个大片段分割成57~59 bp的 5~11个寡聚核苷酸短链,设计合成5对内引物和1对外引物,经重叠PCR扩增获得mHPV18L1全长基因,纯化后将其克隆入pMD18T载体,酶切、测序鉴定插入子.结果 以重叠PCR成功扩增获得mHPV18L1全长,pMD18T-mHPV18L1重组质粒经酶切、PCR鉴定均得到预期1749 bp大小的片段,并经测序验证.结论 获得以植物偏爱密码子进行序列优化的mHPV18L1全长基因及其重组质粒pMD18T-mHPV18L1,为后续mHPV18L1的植物转化研究奠定了一定的工作基础.
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构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体
目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.
