首页 > 文献资料
-
非蛋白巯基对顺铂在HEK293细胞内累积量的影响
谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰-半胱氨酸(NAC)等非蛋白巯基(NPSH)化合物因含巯基(-SH)而具有亲核和还原特性,有参与解毒或保护上皮细胞免受氧化剂和其他活性亲电物的损伤.肝脏是血浆GSH的主要来源,肾小管上皮细胞主要从血浆摄取现成的GSH,也可通过摄取半胱氨酸或NAC自行合成GSH.肾毒物被摄取进入细胞内或在细胞外(即血浆)均可与NPSH相遇,或被解毒,或形成加合物而影响肾毒物的吸收[1].肾小管上皮细胞是抗癌药顺铂(CP)毒性作用的主要靶细胞,GSH和NAC对CP肾毒性均具有防护作用[2,3].本研究模拟体内模式探讨细胞内外GSH和NAC对CP在肾小管上皮细胞内的累积量的影响及与其防护CP肾毒性的关系.
-
JNK/SAPK信号转导通路在镉引起的Hormesis中的作用
目的 研究重金属镉对Hek293细胞的低剂量兴奋效应及JNK/SAPK信号转导通路在其中所起的作用.方法 以0,1.0,3.0,9.0,27.0 μmol/L浓度的氯化镉(CdCl2)染毒Hek293细胞24和36 h;在研究JNK/SAPK信号转导通路特异性抑制剂作用时,在染毒前先用SP600125预处理1 h.用MTT法测定细胞的增殖.用Western Blot方法检测磷酸化JNK/SAPK蛋白水平的变化.结果 1.0 μmol/L剂量的CdCl2染毒Hek293细胞24和36 h,其增殖率与对照组相比分别升高了9.96%和33.3%,差异均具有统计学意义,加入SP600125后,与对照组相比增殖率没有明显的升高;而在3.0μmol/L剂量以上染毒浓度时,增殖率随剂量增加而降低.1.0,3.0μmol/L剂量CdCl2作用于Hek293细胞对磷酸化JNK蛋白无明显影响,高于3.0μmol/L剂量时可以使JNK蛋白持续磷酸化激活至少12 h.当加入SP600125后,以上变化趋势不受影响.结论 低剂量CdCl2作用于Hek293细胞可以引起Hormesis效应,该效应可以被JNK/SAPK信号转导通路特异性抑制剂SP600125阻断.JNK/SAPK信号转导通路对Hormesis效应的影响可能主要是JNK蛋白下游转录因子的作用.
关键词： 镉 Hormesis HEK293细胞 增殖 JNK/SAPK信号转导通路 -
ERK信号转导通路在CdCl2诱导HEK293细胞低剂量兴奋效应中的作用
目的 探讨ERK信号转导通路在CdCl2诱导HEK293细胞低剂量兴奋效应过程中的作用.方法 以0、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50和500μmol/L浓度的氯化镉(CdCl2)分别染毒HEK293细胞12h和24h;在染毒前分别用ERK1/2抑制剂PD98059(100μmol/L)、U0126(25μmol/L)和c-raf shRNA对细胞进行预处理.采用MTT、WST-8法测定细胞增殖情况,采用western blot检测ERK、c-raf磷酸化蛋白表达水平,采用RT-PCR检测c-fos、c-myc、c-raf基因表达水平.结果 CdCl2作用于HEK293细胞后,CdCl2浓度为0.5(12h)、0.05μmol/L(24h)时可引起细胞增殖明显增加(P＜0.05),浓度为50、500μmol/L时可引起细胞增殖明显减少(P＜0.05);应用ERK通路抑制剂和c-raf shRNA对细胞进行预处理后,未观察到细胞增殖明显增加.CdCl2作用于HEK293细胞3h、6h、12h后,c-fos基因转录水平在CdCl2浓度为0.5μmol/L时明显增高(P＜0.05),c-myc基因转录水平随CdCl2浓度的升高而增高,浓度为5、50μmol/L时增高明显(P＜0.05),pERK蛋白表达无明显变化(P＞0.05).结论 0.5(12h)和0.05μmol/L(24h)CdCl2作用于HEK293细胞可以引起Horme8is效应,ERK信号转导通路中c-fos基因的表达变化在此过程中可能发挥重要作用.
-
吴茱萸次碱对肝肾毒性的初步研究
目的:探讨吴茱萸次碱Rutecarpine(Rut)在体外对人正常肝细胞(HL7702)、人胚胎肾细胞(HEK293)的影响,采用共培养体系初步比较Rut对肝肾细胞活力的影响,并选用小鼠进行整体验证.方法:①采用MTT法检测Rut在肝肾细胞单独培养或共培养体系中对细胞活力的影响并采用倒置显微镜对细胞形态进行观察;②给予Rut后,检测肝肾细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),尿素氮(BUN),肌醉(Cr),乳酸脱氢酶(LDH)的变化;③整体实验观察静脉给予Rut对小鼠肝肾功能和组织病理学的影响.结果:①MTT法显示,2,4 μg·mL(-1)的Rut使肝肾细胞活力均下降,且相同浓度下的Rut对肝细胞的抑制作用大于肾细胞;②4 μg·mL(-1)的Rut使肝细胞上清液中的AST,ALP,LDH水平均升高(P<0.01);③整体实验表明,小鼠静脉给予10 mg·kg(-1)Rut 7 d后,血清中的ALP水平有极显著的上升(P<0.01),ALT,AST,BUN,Cr水平只出现升高的趋势,病理学检查发现约1/3的小鼠肝脏出现肝细胞核分裂象增多,仅有1只小鼠肾脏出现嗜碱性病变.结论:大剂量Rut可能对肝肾具有一定的毒性作用,肝肾细胞共培养体系与细胞单独培养体系均可用于药物对细胞的毒性研究.
-
用肝肾共培养体系研究细胞毒性的方法学考察
目的 建立肝肾共培养体系,并证明此体系的合理性与可行性 方法 采用MTT法比较川楝素(20、40、80、160 μg/mL)、葛根素(200、100、50、25 μg/mL)、苦参碱(5、2.5、1.25、0.625 mg/mL)、汉防己乙素(50、25、12.5、6.25 mg/mL)在肝肾单独培养和共培养体系中对肝、肾细胞活力的影响.结果 2种体系中:川楝素仅对肝细胞的活力有抑制作用,葛根素对肝肾细胞均无抑制作用,苦参碱对肝细胞活力的抑制程度大于肾细胞,汉防己乙素对肾细胞活力的抑制程度大于肝细胞.结论 用肝肾细胞共培养体系与单独培养体系进行实验得出的结果一致,这2种体系均可用于药物对细胞的毒性研究,其中共培养体系能更好地反映药物对靶器官的选择性.
-
碱性成纤维细胞生长因子对人胚肾HEK293细胞蛋白激酶B活性的影响
目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人胚肾HEK293细胞蛋白激酶B(PKB)活性的影响.方法以[γ-32P]ATP掺入法观察不同作用时间bFGF对HEK293细胞膜、胞浆PKB活性的影响. 结果75μg/LbFGF刺激HEK293细胞10 min,使胞液和膜性PKB酶活性达高峰.Wortmannin预处理后,HEK293细胞膜和胞浆PKB活性在各时间点均明显降低. 结论bFGF能通过PI3K途径迅速激活HEK293细胞的PKB活性.
-
H3亚型流感重组腺病毒候选疫苗的构建及鉴定
目的 研制一种制备工艺简单、无需鸡胚即可大量生产的预防季节性H3亚型流感重组腺病毒候选疫苗.方法 构建含有外源H3HA基因的重组腺病毒穿梭载体质粒pacAd5 H3HA,并用酶切的方法进行鉴定;将鉴定阳性的pacAd5-H3HA与腺病毒骨架载体质粒线性化后用脂质体介导共转染HEK293细胞,分别采用RT-PCR、间接免疫荧光试验以及Western blot方法对构建的H3亚型流感重组腺病毒疫苗进行鉴定. 结果 RT-PCR扩增出约1.8 kb片段,与目的片段大小相同,表明外源基因H3HA成功插入重组腺病毒.间接免疫荧光试验显示重组腺病毒转染后的HEK293细胞中检测到特异性蛋白,Western blot显示在70 ku处有一反应条带,表明该H3HA蛋白能被兔抗H3亚型HA蛋白血清识别. 结论 构建的H3亚型流感重组腺病毒能在HEK293细胞中表达具有反应原性的H3HA蛋白,为后续的动物实验奠定了基础.
-
KCNE1亚基对Cav1.2电流的调节及门控机制
目的 探讨KCNE1对Cav1.2电流的调节及门控机制.方法 采用瞬时转染的方法,将Cav1.2通道质粒单独或与KCNE1质粒共同转入HEK293细胞上,实验分Cav1.2组和Cav1.2+KCNE1组(每组取15个细胞),采用全细胞膜片钳技术记录Cav1.2电流和门控动力学.结果 KCNE1与Cav1.2共同转染后,Cav1.2电流显著降低.在0 mV时,Cav1.2峰电流密度从(-14.8±2.5)pA/pF降为(-7.5±1.6)pA/pF(n=15,P<0.01).门控机制研究发现,KCNE1对Cav1.2电流的调节主要是使通道稳态失活曲线向更负的方向移动,进而加速失活;同时,也使通道失活后恢复减慢,失活时间常数延长,两方面共同作用导致电流密度的降低.结论 KCNE1亚基可以通过改变Cav1.2通道稳态失活和失活后恢复过程降低其电流密度.
-
人胚肾(HEK293)细胞自身的钾通道
目的 研究人胚肾(HEK293)细胞自身的电压依赖性的钾通道.方法 利用全细胞膜片钳技术,记录HEK293细胞上的外向电流及其通道的电生理特点.结果 HEK293细胞上未发现氯电流.59.7%的细胞表达一种类似瞬间外向钾电流(Ito)的钾电流,该电流对4-AP敏感,2mmol/L的4-AP可明显抑制此电流.在40mV时,此电流幅度为(175±112)pA.失活曲线显示其通道的半数失活电压为(-3.5±0.9)mV,斜率为(6.3±0.8)mV.该通道从失活状态中恢复的时间常数为(333.3±33.9)ms,其失活动力学曲线呈钟形.结论 HEK293细胞自身存在Ito样电流,且此电压依赖性钾通道是其自身表达的主要的有功能的离子通道,提示在利用此广泛应用的表达系统来研究外源性离子通道的时候,应该加倍注意.
-
pEGFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGEP)融合的人apelin受体(Apelin receptor,apelin-R)真核表达载体.方法 以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人apelin受体.扩增的人apelin受体用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒peGFP-C1.然后将两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞,共聚焦显微镜观察.提取转染细胞的总蛋白,进行Western blot检测.结果 扩增出一条约1 200bp的片段,与预期的apelin受体大小相符.酶切结果显示,重组质粒pEGFP-hApelin-R被切成两条片段,其中一条为peGFP-C1载体大小,另一条为目的 片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank(NM_005161)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,人apelin受体主要在细胞膜上表达.Western blot结果显示在相对分子质量69 000处有一蛋白条带,与预期大小相符.结论 构建成功pEGFP-hApelin-R重组表达载体,此表达载体可用于检测apelin受体和κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)或与其他受体间的相互作用.
-
人HCN2基因编码的心脏起搏通道的电生理
目的将人超极化激活的阳离子通道基因2(human hyperpolarization-activated cation channel 2,hHCN2)表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点.方法利用全细胞膜片钳技术,记录转染了hHCN2的HEK293细胞上的超极化激活的阳离子流(If).结果转染hHCN2的HEK293细胞上表达If样内向电流,在超极化时激活,随刺激电压的延长而增大,半数大激活电压为(-109.1±0.7)mV,曲线斜率为(-12.7±0.7)mV.刺激电压变负时,激活变快.-100mY和-160mV时,激活时间常数分别为(2.5±1.1)s和(217±29)ms.此电流是细胞外钾离子浓度依赖性的,对钠离子和钾离子的相对通透性为0.67.2mmol/L的Cs+可明显抑制此电流.结论目的基因hHCN2在HEK293细胞上成功表达,表达的蛋白能形成有功能的通道,产生If样电流.
关键词： 超极化激活的阳离子通道 HEK293细胞 全细胞 -
VEGF165-PE38重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达
目的 构建血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38)基因的真核融合表达载体,研究其在HEK293细胞中的表达情况.方法 通过PCR获得实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP,重组质粒经限制性内切酶及DNA序列测定证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染HEK293细胞,然后用RT-PCR及ELISA法检测VEGF165-PE38融合蛋门在HEK293细胞的表达.结果 酶切分析及DNA序列测定证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT-PCR及ELISA法检测证实重组基因可在HEK293细胞表达.结论 VEGF165-PE38融合基因可在HEK293细胞中表达,为进一步研究其对肿瘤血管内皮细胞的靶向毒性及临床应用奠定基础.
-
丁酰胆碱酯酶基因-壳聚糖纳米粒初步研究
目的优化抗毒酶基因纳米粒制备工艺,并对纳米粒部分性质进行研究.方法用复凝聚法制备抗毒酶基因纳米粒,采用规 格化的正交表安排试验,用SAS统计软件处理数据;用透射电镜观测纳米粒粒径和形态;用P cs测定粒径和Zeta电位;用体外转染试验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置显微镜观察转染结果.结果正交设计试验结果表明,优化的抗毒酶基因纳米粒 制备条件是:壳聚糖浓度300μg·ml-1,丁酰胆碱酯酶基因质粒浓度100μg·ml -1,硫酸钠浓度8mmol·L-1,pH值5.5,涡旋混合时间30s.所制备的纳米粒在透射 电镜下观察,结果表明:绝大多数粒子的粒径在100nm以下,粒径分布比较均匀.Pcs测定结 果表明:98%以上的粒子粒径分布在50～100nm范围,与透射电镜结果相符;平均Zeta电位为 15.9±6.3mV.体外基因转染试验表明:纳米粒能将所包裹的基因递送到细胞内,并表达目标蛋白-丁酰胆碱酯酶.结论壳聚糖浓度、质粒基因浓度以及它 们之间的交互作用,在制备条件选择中具有决定性作用,丁酰胆碱酯酶基因-壳聚糖纳米粒 制备工艺可行,递送基因能力较强.本研究结果表明:壳聚糖纳米粒作为基因递送载体具有广阔的发展空间.
-
载报告基因壳聚糖纳米粒制剂体外转染活性考察
目的考察壳聚糖纳米粒体外基因转染活性及壳聚糖纳米粒经表面修饰的体外转染活性变化.方法用复凝聚法制备纳米粒,透射电镜观察粒子形态,体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果.通过考察递送不同剂量的基因和转染后不同时间的转染效率,寻找本递送系统较好的转染条件.用纳米粒表面连接PEG以及半乳糖基白蛋白,对纳米粒进行修饰,通过体外转染实验,评价表面修饰对其转染活性的影响.结果未经表面修饰的载基因纳米粒能够转染人胚胎肾细胞(HEK293)和肝癌细胞(HepG2),但转染效率仍不如脂质体转染试剂,且在转染实验后约72h较高,递送基因较佳的剂量是4μg,在以上两种细胞中,转染效率也不同.经PEG表面修饰的纳米粒仍保持纳米粒的体外转染活性.连接半乳糖基牛血清白蛋白的纳米粒转染活性却反而略有下降.结论壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,可以用作基因递送的载体系统,值得进一步研究.经PEG表面修饰和冷冻干燥处理,保持生物活性,为基因药物制剂化的可能性提供了证据.对于靶向配基的选择,宜继续进行筛选.
-
雌激素对Kv2.1钾电流及大鼠海马神经元延迟整流钾电流的影响
目的研究17β-雌二醇对Kv2.1钾电流和原代培养大鼠海马神经元延迟整流钾电流的作用.方法采用HEK293-Ky2.1细胞培养、大鼠海马神经元原代培养和膜片钳全细胞记录技术.结果17β-雌二醇浓度依赖地抑制Ky2.1钾电流和原代培养大鼠海马神经元延迟整流钾电流(IK).17β-雌二醇抑制Ky2.1钾电流和原代培养大鼠海马神经元延迟整流钾电流的IC50分别为2.4和4.0 μmol·L-1.通道动力学研究发现,17β-雌二醇(3 μmol·L-1)显著左移Ky2.1钾电流的稳态激活和失活曲线,但只显著左移海马神经元延迟整流钾电流稳态激活曲线,而不影响该电流的稳态失活曲线.结论17β-雌二醇抑制Ky2.1钾电流与抑制IK的程度相近,17β-雌二醇抑制IK的作用可能部分通过阻断Ky2.1钾电流而实现.
-
重组人乙酰胆碱酯酶的表达及其抑制剂的筛选
本研究旨在表达重组人乙酰胆碱酯酶(recombinant human acetylcholinesterase,rhAChE)并应用于乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选研究.利用质粒pCMV-AChE瞬时转染HEK293细胞,分泌表达rhAChE.考察rhAChE的酶活性:以碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)为底物进行酶底物动力学研究获得rhAChE的米氏常数Km,以多奈哌齐(donepezil)为抑制剂进行酶抑制作用动力学研究获得Ki、Ki’等参数.利用rhAChE测定新化合物的IC50值,评价新化合物的抑制活性,同时将研究结果与文献报道的提取大鼠AChE的抑制活性进行比较.结果测得rhAChE的Km为151.9 μtmol·L-1,多奈哌齐对rhAChE的抑制作用为竞争性和非竞争性结合的混合类型(Ki=16.03 nmol·L-1,Ki'=18.36 nmol·L-1),rhAChE可应用于抑制剂筛选研究.
-
大蒜素对SCN5A-F1473S突变致钠电流降低的逆转作用
本文旨在研究大蒜素(allitridum,All)对SCN5A-F1473S突变的HEK293细胞钠电流降低的逆转作用,为筛选治疗Brugada综合征的新药提供理论依据.采用瞬时转染的方法,将SCN5A-F1473S通道质粒转入HEK293细胞,采用细胞外灌流和共培养模式的方法将All急性和慢性给药,使其作用浓度为30 μmol·L-1.采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录电流和门控动力学,采用共聚焦显微镜技术和蛋白质免疫印迹技术检测通道蛋白在细胞膜表达,探讨All对SCN5A-F 1473S峰钠电流降低的逆转作用.发现All 30 μmol·L-1组的HEK293细胞峰钠电流(269.8±16.6 pA/pF)显著增加(P＜0.01),几乎接近对照组电流密度(298.2±17.5 pA/pF,P＜0.01).All可使通道稳态失活向更正的方向移动(V1/2,inact恢复至-79.5±2.4 mV,P＜0.01),导致失活减慢,并且使通道中间态失活减缓(延长至598.1±22.6 ms,P＜0.01).同时,All增加通道蛋白在细胞膜的分布和表达(与F1473S相比,P＜0.01).All使SCN5A-F 1473S突变的细胞电流增加,其主要机制可能与此药物能减慢通道失活及改善突变通道迁移障碍有关.
-
镉诱导HEK293细胞自噬和凋亡
目的：探究镉（二氯化镉，CdCl2）能否诱导HEK293细胞自噬与凋亡以及细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2和AKT蛋白在自噬中的作用。方法将绿色荧光蛋白（GFP）-微管相关蛋白Ⅰ轻链3B（LC3B）重组质粒转染至HEK293细胞24 h后，以CdCl22，4，8和10μmol·L-1诱导细胞12 h，荧光显微镜观察自噬情况；以CdCl22，4，8和10μmol·L-1诱导未转染GFP-LC3B重组质粒的HEK293细胞12 h，透射电子显微镜下观察自噬泡；Western蛋白印迹检测LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达变化，以及ERK1/2和AKT蛋白的磷酸化表达；流式细胞仪检测CdCl2（≤10μmol·L-1）对HEK293细胞凋亡的影响。用3-MA（自噬抑制剂）预处理CdCl210μmol·L-1诱导的HEK293细胞12 h，Western蛋白印迹检测细胞内激活型胱天蛋白酶3的表达。结果 CdCl2（≤10μmol·L-1）诱导HEK293细胞12 h，荧光显微镜下转染细胞出现绿色荧光点状聚集，电镜下观察到自噬泡，Western蛋白印迹检测到LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达量增加（P<0.05，P<0.01），ERK1/2和AKT蛋白磷酸化水平均增加（P<0.05， P<0.01）。流式细胞仪检测出CdCl2（≤10μmol · L-1）诱导的HEK293细胞发生了细胞凋亡；加入3-MA 20μmol·L-1+CdCl210μmol·L-1后，细胞自噬被抑制，激活型胱天蛋白酶3表达增加（P<0.01）。结论低浓度CdCl2（≤10μmol·L-1）能引起细胞自噬，可能通过ERK1/2和AKT蛋白介导细胞自噬；自噬与凋亡相伴发生，自噬可能抑制凋亡。
-
大鼠嘌呤能受体 P2 X4稳定表达细胞系的建立及功能的验证
目的：建立大鼠嘌呤能受体 P2 X4（rP2 X4）稳定表达细胞系，并对细胞系功能进行验证。方法构建绿色荧光蛋白rP2X4受体（pEGFP-N1-rP2X4）重组质粒，采用脂质体转染法将pEGFP-N1-rP2X4转染于人胚肾（HEK293）细胞，采用抗生素G418（1 g·L-1）压力筛选，qRT-PCR和Western蛋白质印迹法验证rP2 X4受体的表达量。全细胞膜片钳技术检测稳定表达的 rP2 X4受体Ca2＋电流。结果测序结果表明， pEGFP-N1-rP2X4重组质粒序列完全正确；采用脂质体法稳定转染HEK293细胞后，qRT-PCR和Western蛋白质印迹法结果表明，HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳定转染细胞系在连续传代25代后（1，3，5，10，15，20和25代）rP2X4受体均保持稳定表达；全细胞电流记录实验表明，嘌呤受体激动剂ATP 3．0μmol·L-1能激活HEK293-pEGFP-N1-rP2X4细胞上表达的 rP2X4受体并产生特异性激活电流，且该电流能被非选择性P2X4受体拮抗剂三硝基苯酚（TNP）-ATP（30．0μmol·L-1）阻断。结论 HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳定转染细胞系上rP2 X4受体表达稳定，激活后能产生特异性激活电流。该细胞系可用于rP2 X4受体的药物筛选及其机制研究。
-
人源去甲肾上腺素转运蛋白稳定表达细胞系的构建及其功能鉴定
目的 构建人源去甲肾上腺素转运蛋白(hNET)稳定表达细胞系,并对细胞系hNET的结合和重摄取功能进行研究.方法 采用脂质体转染法将hNET转染于母细胞-人胚肾(HEK) 293细胞(HEK293-hNET);采用RT-PCR和Western蛋白质印迹法在基因和蛋白水平对HEK293-hNET细胞系进行鉴定和稳定性验证;采用放射性配基结合实验检测HEK293-hNET的结合和重摄取功能.并采用三环类抗抑郁药地昔帕明(DIM)和5-羟色胺/去甲肾上腺素双重重摄取抑制剂度洛西汀(DLX),在0～1×10-4 mol·L-1浓度梯度范围绘制药物与hNET的结合与重摄取抑制曲线,进一步验证HEK293-hNET细胞系的结合和重摄取功能.结果 RT-PCR和Western蛋白质印迹实验结果表明,所建立的HEK293-hNET细胞系在15代内均稳定表达hNET;放射性配基结合实验表明,HEK293-hNET细胞具有内源性hNET的结合和重摄取功能.并且,DIM和DLX与HEK293-hNET细胞中hNET具有明显的特异性结合(Ki值分别为2.45和3.40 nmol· L-1),并可显著抑制hNET对去甲肾上腺素的重摄取作用(IC50分别为5.78和10.23 nmol· L-1).结论 成功建立的可稳定表达hNET的HEK293-hNET细胞系具有内源性hNET的结合和重摄取功能,可用于hNET靶标药物研究.
关键词： 去甲肾上腺素转运蛋白 HEK293细胞 抗抑郁药 去甲肾上腺素 细胞转染
