腺苷二磷酸核糖基化及其生物学效应

真核生物体内蛋白质表达后均需经过一系列的修饰过程才能发挥作用,主要包括腺苷二磷酸(ADP)核糖基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等.ADP-核糖基化是蛋白质翻译后的重要修饰方式之一,分为单-ADP-核糖基化,聚-ADP-核糖基化2种,其与染色质的功能与调节、肿瘤的发生、细胞死亡、细胞分化与信号转导、程序性细胞死亡等很多重要的生命活动相关[1-2].笔者将重点介绍哺乳动物细胞中的酶促的单-ADP-核糖基化反应和聚-ADP-核糖基化反应,以及这些反应的主要生物学效应.

沙棘总黄酮对大鼠缺血心肌组织蛋白质表达的影响

目的:探讨沙棘总黄酮对缺血心肌的保护作用及其相关蛋白表达谱的改变.方法:应用表面增强激光解吸离子化(surface enhanced laser desorption/lonization,SELDI)蛋白质芯片技术检测了经沙棘总黄酮处理后的缺血心肌组织和未经沙棘总黄酮处理的对照组缺血心肌组织中的蛋白质谱.用PHS-C型蛋白芯片阅读机读取数据并进行比较分析.结果:与对照组相比,在经沙棘总黄酮处理后的缺血心肌组织共捕获6个存在有差异的蛋白质峰,其中有4个出现在IMAC3芯片上,1个出现在SAX2芯片上,1个出现在NP20芯片上.6个差异蛋白质峰中,有1个呈高表达,5个呈低表达.结论:沙棘总黄酮在缺血心肌组织中可调节相关蛋白表达谱从而产生保护作用.

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPWt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性.限制性酶切反应与测序表明.三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示.三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T＝25℃,t＝10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western bIot检测显示.纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合.这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性.

脓毒症患者外周血淋巴细胞PPARγ表达和活性的变化

目的 探讨不同病情程度和不同预后的脓毒症患者外周血淋巴细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的蛋白质表达量和活性的变化.方法根据2003年美国胸科医师学会/危重病医学会制定的脓毒症诊断标准,收集2007年12月至2008年3月复旦大学附属中山医院急诊科和外科ICU收治的48例脓毒症患者进行前瞻性研究,另选16例健康成年人作为对照.排除既往患有自身免疫性疾病、正在应用免疫抑制剂、AIDS和肿瘤患者.本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会同意.根据患者的病情程度分为轻度脓毒症组和严重脓毒症组;根据患者28 d是否存活,分为存活组和死亡组.利用Ficoll梯度离心法分离患者外周血淋巴细胞.分别采用蛋白质印迹(Western Blotting)和凝胶电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)方法测定外周血淋巴细胞PPARγ蛋白质表达量和活性变化.采用急性生理学与慢性健康评分Ⅱ(APACHEⅡ)系统对患者进行病情程度的评分.组间比较采用单因素方差分析.结果 轻度脓毒症患者外周血淋巴细胞PPARγ蛋白质表达和活性(0.56±0.12,4.13±0.22)与正常对照组相比(0.39±0.07,2.42±0.17)明显增加、增强(P<0.05);严重脓毒症患者外周血淋巴细胞PPARγ蛋白质表达量和活性明显下降(0.30±0.07,1.63±0.12),均低于正常对照组和轻度脓毒症组(P<0.05).与脓毒症存活组患者相比(0.54±0.11,3.59±0.34),死亡组患者PPARγ蛋白质表达量和活性明显下降(0.21±0.08,1.94±0.25),差异具有统计学意义(P<0.05).结论 外周血淋巴细胞PPARγ蛋白质表达量和活性对于预测脓毒症患者的病情程度和预后具有一定的参考价值.

PDGF-BB对成年雌性大鼠成骨细胞雌激素受体α蛋白质表达影响的实验研究

目的 通过研究PDGF-BB与ERα的关系,探讨PDGF-BB在骨代谢中的作用机理,并对其在骨质疏松症中的应用前景进行展望.方法 ①利用酶消化法分离培养成年雌性大鼠的成骨细胞;②对培养的成骨细胞及其雌激素受体α进行鉴定;③分别加入浓度为0 ng/ml、0.1ng/ml、1 ng/ml、10ng/ml的PDGF-BB,共同培养7 d,并设阳性对照组和阴性对照组;④Western blotting化学发光法检测ERα蛋白质,GIS-2010凝胶图象处理系统分析结果 .结果 ①培养的细胞为成骨细胞,免疫组化显示ERa位于胞核;②SDS-PAGE电泳显示在66kD处有清晰的蛋白条带;③Western blot显示10 ng/ml组、1 ng/ml组、0.1 ng/ml组ERa蛋白条带较0 ng/ml组清晰,且10ng/ml组明显.结论 PDGF-明具有促进成骨细胞雌激素受体α蛋白表达的作用,雌激素受体α蛋白含量随着PDGF-BB浓度的增加而呈增加的趋势.

咪唑啉受体抗血清选择性蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:表达和纯化咪唑啉受体抗血清选择性蛋白(imidazoline receptor antiserum-selected protein,IRAS protein),制备IRAS蛋白的单克隆抗体.方法:采用基因重组技术在大肠杆菌表达IRAS蛋白;金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以间接ELISA方法筛选分泌特异性IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞;采用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体的特异性.结果:成功表达并纯化了IRAS重组蛋白,纯度达到95%.共筛选出5株分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了IRAS的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体效价分别为1∶ 8×106,1∶ 2×106和1∶ 5×106,属于IgG1亚型.该抗体能与原核及真核系统表达的IRAS重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光显示IRAS蛋白主要定位于细胞质中.结论:建立了稳定分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,成功制备了特异性好的IRAS单克隆抗体,为研究IRAS的功能提供了有力的研究工具.

低剂量辐射对小鼠胸腺细胞浆和细胞核蛋白质表达的影响

目的研究低剂量电离辐射对昆明小鼠胸腺细胞浆和细胞核蛋白质表达的影响.方法在分离75 mGy照射组和假照射组小鼠胸腺细胞浆和细胞核的基础上,采用Sephadex G-100凝胶过滤和高效液相分析两组小鼠胸腺细胞蛋白质的表达,通过小鼠脾淋巴细胞转化和人外周血淋巴细胞染色体畸变检测这些蛋白质表达的生物活性.结果胸腺细胞浆相对分子质量为61.4×103的蛋白质和胸腺细胞核相对分子质量30.4×103的蛋白质照射组比假照射组明显增加.并且这些增加的蛋白质组分对ConA刺激正常小鼠脾淋巴细胞转化和X射线损伤人外周血淋巴细胞所致染色体畸变具有刺激和保护作用.结论低剂量辐射兴奋效应可能与胸腺细胞浆61.4×103的蛋白质和胸腺细胞核30.4×103的蛋白质表达增高有关.

补肾法对酒精干预人成骨样细胞OS-732蛋白质表达的影响

目的 观察成骨样细胞在酒精干预后的变化和补肾中药对其的治疗作用.方法 首先用新西兰兔14只,随机分配成中药六味地黄丸治疗组和生理盐水空白对照组.依据人与兔关系换算出治疗组每日用药5.4 g,用温生理盐水10 mL融解灌胃;空白对照组灌胃等量生理盐水,1次/d,连续3 d,末次双倍量灌胃2 h后采血制备含药血清.然后将含药血清与RPMI 1640 细胞培养基配成浓度为5%、10%、20%培养液,对细胞进行培养,通过观察细胞生长曲线,得出佳含药血清浓度为10%.后将人成骨样细胞OS-732分为酒精干预组、药物治疗组、空白对照组进行培养并收集细胞.每组细胞提取总蛋白后进行双向凝胶电泳技术分离,得出蛋白质点电泳凝胶图谱,利用计算机图像分析软件分析找出差异蛋白质点.结果 酒精干预组、药物治疗组、空白对照组比较,表现明显差异的蛋白点有5个(即SSP1002、SSP1401、SSP1602、SSP8501、SSP8504),酒精干预组与空白组比较蛋白点表达均降低;药物治疗组与酒精干预组比较,这5个蛋白点表达均得到不同程度的逆转.结论 补肾中药可能能够提高受损成骨细胞的蛋白表达.

信号肽序列在酵母分泌表达系统中的应用

酵母是一个近年来被广泛使用的真核表达系统,应用信号肽序列构建酵母分泌表达系统,即可方便纯化操作,又可提高外源蛋白的分泌表达效率.本文将从信号肽结构特征、常用的信号肽序列以及构建高分泌型载体等方面进行综述.

褪黑素对核因子κB蛋白质表达影响的研究进展

大多数生物学过程都需要核因子κB(NF-κB)的参与,了解其通路过程对相关疾病的治疗有深远影响.近期发现,褪黑素作为一种吲哚类激素,自身能改变NF-κB信号通路转录过程.国内外文献表明,在消化系统、呼吸系统、心血管系统、神经系统、生殖系统等方面各类疾病的研究中,褪黑素对NF-κB蛋白质表达起抑制作用,在分子水平阻断NF-κB转录过程,下调或阻止表达产物生成,终产生特殊的生理学效应,对从分子信号通路方面研究疾病的治疗提供了依据.

非毒性结节性甲状腺肿蛋白质表达差异的初步研究

目的：比较非毒性结节性甲状腺（NTNG）组织和正常甲状腺组织整体蛋白质表达，以研究非毒性结节性甲状腺组织蛋白质表达差异。方法提取NTNG甲状腺组织和正常甲状腺组织总蛋白，利用双向凝胶电泳技术分离各组总蛋白；经MALDI- TOF / TOF质谱分析，搜索数据库，寻找匹配的相关蛋白质，鉴定蛋白质，获得差异蛋白质的信息。结果经过初步筛选和质谱分析共获得9个具有统计学意义的表达差异蛋白点，其中4个在非毒性结节性甲状腺高表达，5个低表达。结论 NTNG与正常腺体组织间存在多种差异表达的蛋白质，可能通过细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等参与NTNG的发生和发展。

蛋白质组学在术后认知功能研究中应用的展望

蛋白质组(proteome)是指一种细胞乃至一种组织、一种生物所表达的全部蛋白质,它主要着眼于一个基因组所表达的蛋白质构成的整体.1999年Nature杂志将蛋白质组定义为:"在一个细胞的整个生命过程中有基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质",这一定义中引入了时间和空间的概念,从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成和活动规律,不仅对细胞内蛋白质进行测量和鉴定,还包括其定位、修饰、活性、功能以及相互作用,终目的是建立完整的蛋白质文库.蛋白质组学研究主要涉及两条发展线:一是表达蛋白质组学(express proteomics)(或称结构蛋白质组学,structural proteomics),指在整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化,是对细胞或组织中的蛋白质表达量化谱的反映;二是功能蛋白质组学(function proteomics),主要研究蛋白质在细胞内的行为、运输及相互作用,从而构建细胞谱蛋白质组学(cell map proteomics).当前蛋白质组研究侧重点在建立正常细胞和组织的蛋白质组表达图谱及蛋白质组数据库,比较分析在病理或治疗干预下蛋白质组变化,通过比较分析,筛选具有特定功能的蛋白质群体.2001年Science杂志就已经把蛋白质组学列为人类六大研究热点之一,可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一.

Golph2蛋白质的原核表达及多克隆抗体制备

目的:新近发现Golph2蛋白与肝癌关系密切,制备Golph2重组蛋白质和多克隆抗体,建立Western blot检测技术,为后续研究提供基础.方法:RT-PCR从人肝癌细胞株WBF44钓取Golph2基因序列,PCR回复突变制备全长完整基因(1 206 bp),将其插入至原核表达载体pET-21、转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE鉴定.将纯化蛋白质免疫家兔,制备多克隆抗血清.建立Western blot 鉴定重组蛋白和抗血清特异性,测定临床血清标本中Golph2蛋白水平.结果:从肝癌细胞中钓取的基因,出现2个碱基置换突变和1个碱基缺失突变,经回复突变,获得与NM 177937完全一致序列.SDS-PAGE和Western blot证实,重组Golph2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白质和73 kD血清蛋白质.结论:Golph2蛋白质表达和抗血清制备完全成功,可以用于后续研究

EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用

目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关.本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平.结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EGFL7.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质.结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.

桦褐孔菌水提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠糖异生和胆固醇合成关键酶表达的影响

[目的]探讨桦褐孔菌水提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠糖异生和胆固醇合成关键酶表达水平的影响.[方法]制备STZ诱导的糖尿病大鼠模型,随机分为糖尿病模型组(阴性对照组)、阳性对照组、桦褐孔菌水提取物大、中、小剂量组.阳性对照组给予200 mg/kg盐酸二甲双胍,桦褐孔菌水提取物给药组分别灌胃给予桦褐孔菌水提取物900,600,300 mg/kg.每日1次,连续给药8周.实验前后测定大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、糖耐量及TG,TC,LDL-C,HDL-C等指标,检测肝组织PEPCK,G-6-PASE,HMG CoA还原酶蛋白表达水平.[结果]与阴性对照组比较,桦褐孔菌水提取物中、大剂量组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白,TC,TG及LDL-C水平显著降低(P＜0.05,P＜0.01),HDL-C水平增高(P＜0.05,P＜0.01),PEPCK,G-6-PASE及HMG CoA还原酶表达水平显著降低,且呈剂量依赖性.[结论]桦褐孔菌水提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠具有较好的降低血糖和血脂水平的作用,其机制可能与降低PEPCK,G-6-PASE,HMG CoA还原酶的表达及减少糖异生和胆固醇合成过程有关.

Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建

目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体.方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达栽体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况.结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核:而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中.结论:三顺反子表达栽体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础.

细颗粒物暴露对人群DNA损伤的影响/表面等离子体共振技术快速筛检人血清蛋白质表达的方法应用

人TSH受体胞外段高效表达质粒的构建、表达及蛋白纯化

利用基因重组方法,构建hTSHRecd基因片段原核表达系统(E.coli M15).hTSHRecd蛋白表达量大,纯化得到毫克级高纯度的hTSHRecd蛋白,可与TSHR自身抗体及TSH特异性结合,具有免疫活性及一定生物活性.

食管鳞癌组织中MUC15基因和蛋白质的表达及其与临床病理因素的关系

目的 探讨MUC15在食管鳞状细胞癌(鳞癌)中的表达及其与鳞癌发生、发展的关系.方法 采用RT-PCR法及免疫组织化学SP法检测53例正常食管黏膜组织、20例不典型增生组织及53例食管鳞癌组织中MUC15 mRNA的相对含量及蛋白质的阳性表达率,并比较其在不同临床病理因素下的差异.结果 在正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中MUC15 mRNA相对表达量分别为0.281±0.017、0.322±0.029、0.790±0.038;蛋白质表达阳性率分别为20.7％、35.0％、88.7％,差异均有统计学意义(P＜0.05).临床分期0～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的食管鳞癌组织中MUC15 mRNA相对表达量分别为0.498±0.029、0.832±0.045;蛋白质表达阳性率分别为70.0％、93.0％,差异均有统计学意义(P＜0.05).有淋巴结转移组与无淋巴结转移组之间mRNA相对表达量分别为0.829±0.031、0.501±0.042;蛋白质表达阳性率分别为90.2％、75.0％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 食管鳞癌组织中MUC15表达量较正常食管组织有明显升高,其异常高表达可能与食管鳞癌的发生、发展有关.

重组人白介素21的表达、分离纯化及其体外生物活性的检测

白介素21(IL-21)是新发现的与白介素2,白介素14和白介素15结构和序列同源的细胞因子.对于T细胞、B细胞和NK细胞有提高免疫应答等多种生物学活性.所以白介素21特别是人源白介素是一个抗肿瘤治疗和其他免疫治疗的一个潜在活性蛋白.为进一步研究IL-21,从刺激过的人外周血单核细胞中成功克隆成熟人白介素21编码基因,经过大肠杆菌密码子偏好的生物信息学分析、突变密码子、转化、诱导和CM-52阳离子交换柱分离纯化,实现了重组人白介素21蛋白在pET22b系统中的无标签表达.并将重组蛋白应用于淋巴细胞增殖实验和直接抗肿瘤(HepG2,K562和MDA)活性检测体外活性检测.结果表明,淋巴细胞增殖与重组人白介素21浓度成正相关,而r hIL-21对人肿瘤细胞无直接抗肿瘤活性.