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miRNA-126靶向抑制A549细胞迁移和侵袭能力的研究
目的 研究microRNA-126(miR-126)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移和侵袭能力的影响. 方法 利用脂质体介导法将构建的miR 126过表达质粒转染至NSCLC细胞株A549细胞(A549/ miR-126组),并设空质粒转染组(A549/MOCK组)和空白对照组(A549组).利用RT-PCR技术检测3组细胞中EGFL7(miR-126的靶标)的表达水平,采用细胞划痕实验观察细胞迁移能力差异,采用Transwell小室法分析3组细胞侵袭能力的差异. 结果 RT-PCR检测A549/miR-126组、A549/MOCK组和A549组细胞中EGFL7 mRNA分别为2.32±0.088、1.43±0.026和1.00±0.000,差异有统计学意义(P＜0.01);细胞划痕实验显示A549/ miR-126组、A549/MOCK组和A549组细胞平均迁移距离分别为3.0 μm、2.65 μm和0.5 μm,平均抑制率分别为0、11.25％和83.75％,差异有统计学意义(P＜0.05);Transwell小室实验显示,A549/miR-126组24 hr侵袭细胞数为(28.6±2.322)个,36 h侵袭细胞数为(29.2±3.7683)个,A549/MOCK组24 h为(49.8±3.7014)个,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 miR-126可上调EGFL7 mRNA的表达,并可能通过表达产物EGFL7蛋白抑制A549细胞的迁移和侵袭能力.
关键词： 非小细胞肺癌(NSCLC) EGFL7 miR-126 -
EGFL7单克隆抗体体外抑制小鼠ACTH垂体腺瘤AtT-20细胞增殖和侵袭的作用研究
目的 观察EGFL7单克隆抗体对小鼠ACTH垂体腺瘤AtT-20细胞增殖和侵袭的影响.方法 MTS试验检测不同浓度EGFL7单克隆抗体处理AtT-20细胞24、48、72 h后细胞增殖活力.ELISA检测不同浓度的EGFL7单克隆抗体处理AtT-20细胞72 h后细胞上清中ACTH的分泌水平.Real-time PCR检测AtT-20细胞经EGFL7单克隆抗体处理24 h后细胞中侵袭相关基因E-cadherin、snail、vimentin的mRNA表达水平.结果 EGFL7单克隆抗体能够有效抑制AtT-20细胞增殖,并呈现良好的时间依赖性与浓度依赖性;同时能够显著降低AtT-20细胞分泌ACTH,呈现良好的剂量依赖作用.Real-time-PCR结果表明EGFL7单克隆抗体能够显著抑制AtT-20细胞中侵袭相关基因E-cadherin、snail、vimentin的mRNA表达.结论 EGFL7单克隆抗体可以显著抑制AtT-20细胞的增殖和侵袭.
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流式细胞术检测EGFL7在肺癌不同细胞株中的表达差异
目的 探讨不同类型肺癌细胞株中EGFL7(类表皮生长因子域7)蛋白的表达差异,为进一步研究EGFL7在肺癌发病机制中的作用奠定基础.方法 选取三种常用的细胞株A549(肺癌腺)、H446(小细胞肺癌)和H69(小细胞肺癌),采用流式细胞仪检测它们的EGFL7的表达,并比较三者之间的差异是否具有统计学意义.结果 流式细胞仪检测结果显示,EGFL7在肺腺癌细胞株A549细胞内的表达(18.17%)明显低于小细胞肺癌细胞株H446(31.20%)和H69(34.33%)细胞内的表达(P＜0.01),两种小细胞肺癌细胞株H446和H69细胞内的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 EGFL7可能在小细胞肺癌的发病机制中发挥重要作用.
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EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用
目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关.本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平.结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EGFL7.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质.结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.
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EGFL7与肿瘤研究新进展
EGFL7蛋白为一种内皮细胞特异性分泌因子,它是血管管腔形成所必需的因子,它的缺乏将导致管腔形成受阻,从而影响血管功能的完善.其在早期胚胎的血管中有较强的表达,而在成年人仅在少数器官(如:心脏、肺脏、肾脏)和肿瘤、炎症组织中有高水平表达.在肿瘤的生长转移过程中新生血管的作用十分重大,阻断肿瘤新生血管EGFL7的表达将有助于抑制肿瘤生长和转移,为肿瘤治疗提供一个新的途径.
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Egfl7及VEGF在鼻咽癌的表达及意义
目的 研究Egfl7及VEGF在鼻咽癌组织中的表达,Egfl7及VEGF之间的关系,Egfl7及VEGF与鼻咽癌的临床关系.方法 采用免疫组化(二步法)检测45例鼻咽癌组织及10例鼻咽部慢性炎症粘膜组织中Egfl7及VEGF的表达.结果 VEGF在鼻咽癌组织中的表达明显高于鼻咽部炎性组织,两组间的阳性细胞数的差异具有统计学意义(P＜0.05);Egfl7在鼻咽癌组织中的表达明显高于鼻咽部炎性组织,两组间的阳性细胞数的差异具有统计学意义(P＜0.05);Egfl7及VEGF在鼻咽癌组织中的表达呈正相关,其相关性具有统计学意义(P＜0.05).结论 (1)Egfl7及VEGF在鼻咽癌组织中的表达较鼻咽部炎性组织高,其可能在鼻咽癌的发生发展过程中具有促进作用;(2) Egfl7及VEGF在鼻咽癌组织中的表达呈正相关,其可能对鼻咽癌的发生,发展具有协同作用.
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慢病毒介导EGFL7沉默对肺癌A549细胞体外生物学行为的影响
目的:通过慢病毒介导沉默表皮生长因子样结构域7基因(epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7)在肺癌A549细胞的表达,探讨EGFL7对A549细胞的增殖、凋亡、侵袭和血管生成的影响.方法:利用慢病毒介导靶向EGFL7的shRNA(LV-RNAi)转染A549细胞,实验分三组:LV-RNAi组(转染LV-RNAi),LV-NC组(转染空病毒)和对照组(A549细胞).Real-time PCR和Western blotting分别检测LV-RNAi感染对A549细胞EGFL7 mRNA和蛋白水平表达的影响,MTT法和流式细胞术分别检测沉默EGFL7对A549细胞增殖和凋亡的影响,Transwell侵袭实验和鸡胚绒毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)实验分别检测沉默EGFL7对A549细胞侵袭和血管生成能力的影响.结果:慢病毒稳定高效地转染A549细胞,LV-RNAi组细胞内EGFL7 mRNA[(0.18 ±0.03)vs(0.98 ±0.05)、(1.03±0.09),P＜0.05]和蛋白表达较LV-NC组和对照组显著降低.与LV-NC组及对照组相比,沉默EGFL7对LV-RNAi组A549细胞的增殖活力[感染120 h时:(0.73±0.22) vs (0.79±0.08)vs(0.81±0.11),P＞0.05]与和凋亡率[感染120 h时:(1.92％±0.06)vs(2.11％±0.07)vs (1.85％±0.13),P＞0.05]均无显著影响;同时,LV-RNAi组A549细胞侵袭入下室细胞数[(61.7±14.5) vs (272.8±21.5)、(286.6±40.0)/mm2,P＜0.05]与血管生成指数[(31.7±4.1)vs(96.3±4.4)、(103.3±6.5),P＜0.05]均显著减少.结论:沉默EGFL基因能够抑制A549细胞侵袭和血管生成能力,但不影响其增殖与凋亡.
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TIE2-R849W突变斑马鱼模型的建立及其在静脉畸形发病中的作用探讨
目的:建立TIE2-R849W突变斑马鱼模型并初步探讨其在静脉畸形中可能的致病机制.方法:通过合成TIE2-R849W突变基因表达体系,利用成熟的mRNA显微注射技术,基于flila:EGFP转基因斑马鱼构建TIE2-R849W过表达斑马鱼模型,荧光显微镜下记录斑马鱼尾静脉丛(caudal vein plexus,CVP)的早期发育改变并定量比较.提取斑马鱼RNA,针对目标基因行实时定量PCR(qRT-PCR),利用已有基因芯片进一步验证结论.采用GraphPad Prism 5.0进行统计学分析.结果:基于对TIE2-R849W过表达斑马鱼模型的观察,TIE2-R849W显著影响斑马鱼早期尾静脉丛的发育,表现为尾静脉丛窦腔数量和面积显著减少.qRT-PCR显示,TIE2-R894W可引发pik3r2 foxo1b的表达上调,而与尾静脉丛发育相关的基因,除显著高表达的egfl7外,nr2f2、nr2f1a和s1pr1均无显著异常表达.比较体外芯片结果,部分突变组内的tie2、pik3r2、oxo16及egft7同样存在一致的高表达.结论:TIE2-R849W引发斑马鱼尾静脉丛发育异常与egfl7的高表达关系密切.
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非小细胞肺癌Egfl7表达与肿瘤转移及预后的关系
目的 了解类表皮生长因子域7(Egfl7)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其意义.方法 应用免疫组织化学法和RT-PCR方法,检测NSCLC标本40例、癌旁肺组织15例、正常肺组织20例中Egfl7蛋白和mRNA的表达水平,结合临床随访资料分析Egfl7蛋白的表达水平与NSCLC预后的关系.结果 NSCLC组织中Egfl7蛋白和mRNA表达水平明显高于正常肺组织,差异有统计学意义(x2=5.96；F=91.22,q=7.49～18.86,P＜0.05).Egfl7表达水平与肺癌淋巴结转移密切相关(x2=5.172,P＜0.05).Egfl7蛋白高表达病人预后明显差于低表达组(P=0.048).结论 Egfl7可作为评估NSCLC转移及预后的一个有价值的标志物,并有可能成为潜在的治疗靶点.
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EGFL7在喉癌组织中的表达及临床意义
目的:探讨喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中EGFL7的表达与喉癌侵袭转移的关系及其可能机制.方法:提取33例新鲜喉癌组织和33例相应的癌旁组织(PNTT)的总RNA,用RT-PCR方法测定EGFL7基因表达,Western-blot方法测定EGFL7蛋白的表达情况；用CD31抗体进行免疫组织化学检测喉癌组织中微血管密度(MVD),并分析EGFL7的表达及MVD与临床病理特征的关系.结果:33例新鲜喉癌标本中EGFL7 mRNA和EGFL7蛋白表达均显著高于癌旁组织(P＜0.01).EGFL7 mRNA和EGFL7蛋白表达具有显著相关性(r=0.786,P＜0.01).喉癌组织中EGFL7 mRNA、EGFL7蛋白的表达水平和MVD与喉癌组织的临床分期、肿瘤的直径大小及有无淋巴结转移等密切相关(P＜0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤原发部位及分化程度等无关(P＞0.05).结论:EGFL7可能通过影响血管生成参与了喉癌的发展.EGFL7蛋白可能成为预测喉癌的病情发展及指导临床治疗的标志物之一.
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EGFL7基因RNAi重组慢病毒的构建及其对喉癌细胞侵袭的抑制
目的:构建类表皮生长因子域7( EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒,观察其对喉癌体外侵袭的抑制作用.方法:筛选确定的EGFL7基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLV载体连接产生LV-sh EGFL7慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用重组慢病毒体外转导喉癌细胞,Western blot法检测喉癌细胞EGFL7蛋白表达.Boyden侵袭小室法实验观察转导shRNA后的喉癌细胞侵袭能力的变化.利用克隆形成实验检测EGFL7基因沉默对Hep-2细胞集落形成能力的影响.结果:成功构建EGFL7的慢病毒载体LV-sh EGFL7,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×108 TU/L.转导siRNA的喉癌细胞EGFL7蛋白表达阴性.EGFL7 siRNA转导后喉癌胞体外侵袭能力下降.EGFL7基因沉默组细胞克隆集落形成率与Hep-2组细胞及空载体组细胞比较,细胞克隆集落形成率显著减低.结论:成功构建人EGFL7基因RNAi慢病毒载体,EGFL7基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用.沉默EGFL7后,Hep-2细胞集落形成能力显著减低,即下调EGFL7基因表达可在一定程度上抑制喉癌细胞的锚着不依赖性增殖能力.
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系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞miR-126及宿主基因EGFL7 DNA甲基化状态分析
目的：探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4+T细胞miR-126宿主基因EGFL7的甲基化水平对miR-126表达的调控。方法：采用实时qPCR检测SLE患者CD4+T细胞miR-126及EGFL7 mRNA表达水平；亚硫酸氢钠基因组测序法检测EGFL7基因启动子区甲基化状态。结果：miR-126及其宿主基因EGFL7在SLE患者CD4+T细胞表达上调(P<0.01)，EGFL7 mRNA表达水平与miR-126的表达呈正相关(r=0.538，P=0.015)。miR-126是一个内含子miRNA，位于宿主基因EGFL7基因座第7个内含子中，其自身的基因序列中包含29个CpG位点。但该区域甲基化水平在SLE患者CD4+T细胞和正常对照组间差异无统计学意义(P=0.907)。而SLE患者CD4+T细胞中EGFL7基因启动子区甲基化水平显著降低(P<0.05)。结论：SLE患者CD4+T细胞miR-126宿主基因EGFL7启动子区甲基化状态调控宿主基因本身及其miR-126的表达。
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EGFL7通过FAK信号促进舌鳞状细胞癌侵袭迁移的研究
目的 探讨EGFL7对舌鳞状细胞癌侵袭、转移能力的调控作用.方法 通过qPCR验证舌鳞状细胞癌与癌旁正常组织以及舌癌细胞中EGFL7的表达水平差异,以舌鳞状细胞癌细胞株SCC-9为实验样品,通过脂质体介导,将EGFL7-siR转染至SCC-9细胞,降低EGFL7的表达水平.采用荧光实时定量RT-PCR检测转染前、后SCC-9中EGFL7的表达变化,通过Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力的改变,Western印迹检测EGFL7的下游信号分子FAK的表达变化.结果 转染EGFL7-siR后的SCC-9中EGFL7的表达明显下调(P<0.001).SCC-9细胞的侵袭迁移能力显著降低(P<0.001).Western印迹检测结果显示,在舌鳞状细胞癌细胞株SCC-9中降低EGFL7的表达水平后FAK磷酸化水平降低,而FAK的表达水平不变.结论 EGFL7的表达水平变化与舌鳞癌的侵袭转移能力密切相关;EGFL7可能通过调控其下游信号通路基因FAK磷酸化水平而发挥作用.
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EGFL7基因过度表达与喉癌分化、转移及预后的关系
目的 探讨喉癌组织中EGFL7基因mRNA表达与喉癌分化、转移及临床预后的关系.方法 收集2008年5-11月共42例行喉癌手术患者的切除标本.用免疫组织化学法检测EGFL7蛋白在42例喉癌组织和配对癌旁组织中的表达情况,提取肿瘤及癌旁组织配对标本的总RNA,用逆转录(RT)-PCR方法测定EGFL7基因表达,蛋白质印迹法测定EGFL7蛋白的表达,并结合临床资料,对EGFL7基因差异表达与喉癌患者临床表现的相关性进行分析研究.结果 对42例配对标本分别进行EGFL7 mRNA荧光检测比较,30例标本的肿瘤组织中EGFL7基因mRNA表达明显高于癌旁正常喉组织.22例标本的肿瘤组织中EGFL7蛋白表达明显高于癌旁正常喉组织.EGFL7 mRNA的表达与喉癌淋巴结转移和浸润深度密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、吸烟、肿瘤分化程度等无关(P>0.05).结论 EGFL7基因在喉癌组织中表达状态与喉癌的生长和浸润转移关系密切,EGFL7基因可望作为喉癌病情发展及指导临床治疗的标记物之一.
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EGFL7和PTEN在人脑胶质瘤中的表达
目的 探讨表皮生长因子样结构7基因( EGFL7)、第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)在脑胶质瘤中的表达和相互关系.方法 应用免疫组化方法检测56例脑胶质瘤和8例脑外伤内减压脑组织中EGFL7和PTEN的表达.结果 EGFL7蛋白在脑胶质瘤组织和正常脑组织中的阳性表达率差异有显著统计学意义(P＜0.01)；高度恶性胶质瘤组阳性表达率明显高于低度恶性胶质瘤组(P＜0.01).PTEN蛋白在脑胶质瘤组织和正常脑组织中的阳性表达率差异有显著统计学意义(P＜0.01)；随着胶质瘤恶性程度的增加,PTEN蛋白的表达相应降低(P＜0.01).EGFL7与PTEN在各级胶质瘤组织的表达呈负相关(r=-0.382,P＜0.01).结论 EGFL7基因可能直接参与了胶质瘤的发生、侵袭过程；PTEN基因突变或丢失、灭活导致PTEN蛋白表达的缺失或减弱在胶质瘤的发生、侵袭发展过程中起重要作用；EGFL7表达与PTEN表达具有明显的负相关性,EGFL7高表达与PTEN表达下降在胶质瘤的浸润发展过程起协同作用.
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EGFL7和FAK在婴幼儿血管瘤组织中的表达及其相关性
目的 探讨表皮生长因子样结构域(EGFL7)和黏着斑激酶(FAK)在婴幼儿血管瘤组织中的表达及相关性.方法 采用免疫组织化学(SP法)方法检测婴幼儿血管瘤和正常皮肤组织中EGFL7和FAK的表达水平;培养脐静脉内皮细胞(HU-VEC),用Western-blot方法,检测在不同重组人EGFL7浓度下,EGFL7和FAK蛋白的表达情况.结果 婴幼儿血管瘤增生期组织中EGFL7和FAK的表达明显高于消退期和正常皮肤组织(P＜0.05),而消退期组和正常皮肤组比较差异无统计学意义(P ＞0.05),EGFL7和FAK蛋白的表达与脐静脉内皮细胞(HUVEC)中重组EGFL7的浓度呈正相关.结论 EGFL7和FAK可能通过影响血管形成参与了婴幼儿血管瘤的发展,EGFL7蛋白可能成为预测婴幼儿血管瘤的病情发展及指导临床治疗的标志物之一.
