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人偏肺病毒F1 、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备
目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础.方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性.取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应.结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架.0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导培养5h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 μg/ml和300 μg/ml.Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1高1:640,抗pET32a-F2高1:40 960.IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光.结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究.
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兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用
目的 制备大鼠精子发生相关蛋白LM23的合成肽多克隆抗体, 对其特性进行初步鉴定,并对LM23多克隆抗体进行初步应用. 方法 利用生物信息学方法分析选择LM23蛋白的多肽序列.应用Fmoc法化学合成大鼠LM23蛋白N端第1～20和第274～291个氨基酸多肽(接近C端), 经C18的RP-HPLC纯化后, 通过高碘酸钠法,将纯化的LM23蛋白的多肽与KLH交联,免疫新西兰大耳白兔,获得LM23蛋白的多克隆抗体.用ELISA方法鉴定多克隆抗体效价.通过Western blot方法鉴定LM23多克隆抗体的特异性并研究LM23在大鼠睾丸中的表达;通过免疫组化方法研究LM23在大鼠睾丸组织和细胞中的定位. 结果 化学Fmoc法分别合成大鼠LM23蛋白N端第1～20,第274～291个氨基酸多肽, 纯化后两条多肽纯度都达到90%以上, 符合免疫用抗原标准.将多肽与KLH交联, 用于免疫动物.经ELISA鉴定,两种多克隆抗体的效价分别达到1∶64 000 和 1∶128 000.应用大鼠睾丸组织切片进行LM23-18肽多克隆抗体的免疫组织化学研究,发现精母细胞有阳性颗粒反应,且LM23主要表达于细胞核. Western blot 研究证实,LM23-18肽多克隆抗体可特异识别大鼠睾丸组织中相对分子量(Mr)约为36 kD的LM23蛋白. 结论 所制备的LM23合成肽多克隆抗体可用于ELISA、Western blot及免疫组化研究.LM23合成肽多克隆抗体的制备为进一步研究LM23的功能和作用机制提供了有力支持.
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直接免疫荧光法检测白色念珠菌
目的探讨多克隆抗体直接免疫荧光法检测白色念珠菌的佳反应条件及临床应用意义.方法观察不同抗体稀释度(1:10～1:2 560),不同孵育时间(15、30、45、60、90、120 min),不同封闭剂(1%、10%牛血清白蛋白及10%小牛血清)和不同菌数对实验效果的影响.结果以抗体稀释度1:40、37℃孵育45 min、封闭剂1%或10%牛血清白蛋白以及菌数1.0×106个/ml和5.0×106个/ml为佳反应条件.结论直接免疫荧光法检测白色念珠菌具有一定的优点和临床应用价值.
关键词： 白色念珠菌 直接免疫荧光抗体实验 多克隆抗体 -
微囊藻毒素(MC-LR)多克隆抗体的制备、纯化及鉴定
目的制备针对藻毒素(MC-LR)的多克隆抗体,并鉴定其特性.方法利用合成的免疫抗原MC-KLH结合物,按常规方法免疫新西兰大白兔20周,经离心、硫酸铵沉淀法制得纯化的抗体,计算其亲和常数,用间接竞争法测定效价、抑制率IC50及特异性.结果纯化的MC-LR抗血清效价大于25600,低检出限为0.01ng/ml,IC50在0.1～1ng/ml之间,与MC-LW和MC-LF的交叉反应率为0.1%～20%.
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β-内酰胺酶广谱特异性抗体制备及免疫分析方法建立
目的 制备能够识别多种β-内酰胺酶结构的广谱特异性抗体,并初步建立用于检测牛奶中违法添加β-内酰胺酶的间接竞争酶联免疫分析方法(ELISA).方法 以混合β-内酰胺酶作为全抗原,免疫动物获得β-内酰胺酶广谱特异性多克隆抗体,分离纯化后进行详细表征,确定佳使用条件,并开发适用于牛奶样品中β-内酰胺酶检测的免疫分析方法.结果 获得了能够识别多种β-内酰胺酶的多克隆抗体,血清中抗体浓度达到17.9-18.9mg/ml,抗体重链和轻链分子量分别为55和25kD,总分子量为160kD,亲和常数为3.6×108 L/mol,以该抗体为基础建立了检测β-内酰胺酶的间接竞争ELISA法,方法检出限为0.2ng/ml,线性范围0.2-200ng/ml,平均回收率在80％～115％之间,相对标准偏差小于20％.结论 获得了β-内酰胺酶多克隆抗体,并建立了间接竞争ELISA方法测定牛奶中β-内酰胺酶含量.
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海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究
目的 建立间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中赤潮毒素记忆缺失性贝毒主要成分软骨藻酸(DA).方法 采用碳二亚胺法,将半抗原DA分别与载体蛋白卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原.以DA-BSA做为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法分析检测海水样品和海洋贝类中的软骨藻酸.结果 低检出限为10.0ng/ml(对于贝相当于4μg/g);海水样品回收率为83.2%～124.7%,批内变异系数在4.7%～5.9%之间;贝类样品回收率为85.9%～99.9%,批内变异系数2.4%～7.1%之间.结论 建立的ELISA方法检测海洋贝类中DA可以满足国际规定的安全限值.
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木瓜凝乳蛋白酶多克隆抗体制备方法的研究
目的 探讨了木瓜凝乳蛋白酶高效价抗体的制备方法.方法将纯化的木瓜凝乳蛋白酶(电泳纯)以三种不同抗原形式--未处理原酶、H2O2抑活的木瓜凝乳蛋白酶、碘乙酸抑活的木瓜凝乳蛋白酶分别免疫雄性白兔,免疫方法采用多次皮下注射和静脉冲击免疫相结合方式进行.从第三次免疫开始,每次免疫后均由耳静脉采血,用Western blotting法和ELISA法检测抗血清,用SAS软件包对数据进行分析比较.结果两种抑活抗原诱导产生的抗血清效价显著高于未抑活抗原(P<0.05),而两种抑活抗原之间无显著性差异;静脉冲击免疫可显著提高机体免疫应答能力,急剧提升抗血清效价.结论抑活抗原比未处理原酶具有更好的免疫原性.与碘乙酸相比,选用H2O2抑活抗原来制备抗体不失为一种经济有效的方法.抑活抗原采用皮下注射及静脉冲击免疫相结合的方式,可十分有效的产生及提高抗血清效价,缩短抗体制备周期.
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A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其免疫磁珠制备技术
目的 制备用于隐蔽态A型单端孢霉烯族毒素富集净化的免疫磁珠.方法 采用A型单端孢霉烯族(简称A型单族)毒素人工抗原3-乙酰-新茄腐镰刀菌烯醇-酸酐-牛血清蛋白(3-Ac-NEOS-HS-BSA)免疫新西兰长耳白兔,分离血清制备A型单族毒素多克隆抗体,测定效价并纯化.然后优化高效价抗体与免疫磁珠的偶联条件并应用.结果 免疫5次后的兔血清中A型单族毒素抗体效价高为1∶64 000.抗体和磁珠的优偶联条件为:24℃、pH 7.4、0.02 mol/L含10％甲醇的PBS缓冲液中旋转捕获24 h.结论 A型单族毒素多克隆抗体及其免疫磁珠的制备为同步富集净化复杂基质中A型单族毒素、提高方法的检测限奠定基础.
关键词： 多克隆抗体 免疫磁珠 A型单端孢霉烯族毒素 -
HIV-1 p15(Gag)基因的克隆、蛋白表达及抗体制备
目的:构建HIV-1 p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体.方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1 p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性.纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性.结果:原核表达载体pET28 a(+)-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20 KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确.纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性.结论:得到纯化的HIV-1 p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础.
关键词： HIV-1 p15(Gag)基因 原核表达 免疫原性 多克隆抗体 -
食品中残留抗生素多克隆抗体的制备
目的 制备5种抗生素的多克隆抗体,为建立农药残留的酶联免疫方法奠定基础.方法 采用重氮化法将甲基磺胺嘧啶、沙拉沙星、洛美沙星、氯霉素及AOZ半抗原与牛血清白蛋白结合形成复合物,作为全抗原免疫新西兰大白兔,通过层析法提取抗体.结果 测定一免、二免、三免后不同时间多克隆抗体的水平,得到5种抗生素的多克隆抗体,效价分析分别为1:12 000,1:10 000,1:10 000,1:8 000,1:16 000.结论 通过观察5种抗生素兔免疫血清的变化,制备高效价的多克隆抗体.
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剑叶龙血素A间接竞争ELISA检测方法的建立
目的:建立间接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于测定剑叶龙血素A(CA)含量.方法:合成半抗原剑叶龙血素A-4'-羧甲基醚(CA-4'-CME),再用碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)分别偶联制备免疫原(CA-BSA)和包被原(CA-OVA),免疫小鼠制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA法并评估其分析性能.结果:通过紫外扫描分析CA-BSA和CA-OVA的偶联比分别为18∶1和24∶1.抗血清效价高达到12000.用四参数logistic方程拟合CA标准曲线,在分析范围0 ～0.80 mg·L-1内,相关系数(R2)≥0.99,IC500.66 mg·L-1,低检测限0.045 mg·L-1,批内CV≤12.5％,批间CV≤14.7％,回收率92.7％ ～ 118.7％,对5种CA类似物的交叉反应率＜5.38％.此方法检测龙血竭和龙血竭总黄酮中CA含量分别为1.27％,3.08％.结论:剑叶龙血素A间接竞争ELISA法精密度、准确度和特异性均较好,可方便地用于药物检测和分析.
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基于寒/热性对照抗原的斑点免疫印迹法中药药性研究
目的:从免疫原性上探讨中药药性的物质基础.方法:以高良姜、肉桂与仙茅3味典型热性中药水提物的混合品作为热性对照抗原,以黄连、大黄与知母3味典型寒性中药水提物的混合品作为寒性对照抗原,免疫家兔后,制备相应多克隆抗体,分别应用寒、热性对照抗原抗体与9味中药水提物作斑点免疫印迹,杂交信号应用Quantity One定量扫描分析.结果:9味中药与热性对照抗原多克隆抗体的印迹信号大小顺序为:干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花、知母、黄连、大黄、黄柏;与热性对照抗原多克隆抗体的印迹信号相似度分别为:57.33%,43.56%,34.16%,30.2%,28.81%,26.53%,21.68%,17.62%,14.85%;9味中药与寒性对照抗原多克隆抗体的印迹信号大小顺序为:大黄、知母、黄连、黄柏、干姜、金银花、秦皮、杜仲、附子;与寒性对照抗原多克隆抗体的印迹信号相似度分别为:55.22%,54.23%,46.72%,34.08%,30.3%,24.48%,24.33%,20.35%,15.17%.以印迹信号相似度为聚类变量,经wistar's Method聚类分析,9味中药被聚为2大类,一大类为:黄柏、知母、黄连、大黄,该大类与寒性对照抗原距离小,与寒性对照抗原的距离依次增大;另一大类为:干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花,该大类与热性对照抗原距离小,与热性对照抗原的距离依次增大.结论:总体上,测试中药与对照抗原抗体的印迹信号相似度越小,其药性与对照抗原的距离越大;斑点免疫印迹法是中药药性物质基础研究的一种实用、有效的新方法.
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狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备
为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体.本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac Ⅰ中,获取的重组质粒pFastbac Ⅰ-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M.用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M.用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性.用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价.结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25 kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力.本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础.
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猪盖他病毒衣壳蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备
原核表达猪盖他病毒(Getah virus)衣壳蛋白(Cap)并制备多克隆抗体.设计一对特异性引物,从含有Cap基因的pT Cap质粒中扩增全长Cap基因,克隆至携带有His标签的原核表达载体pCold Ⅰ中,通过PCR、酶切鉴定和序列测定后,重组质粒pCold-Cap转化大肠杆菌Rosetta 2,IPTG诱导后SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白；蛋白经镍柱纯化后切胶免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体.实验表明:经终浓度0.1 mmol/L IPTG 15℃诱导24 h后,Cap基因在Rosetta 2中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的40.2％,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为32.3 kD.Western blot显示制备的鼠源抗血清可以与融合蛋白发生反应,有明显的特异性条带.猪盖他病毒衣壳蛋白原核表达成功,制备的多抗可以识别Cap蛋白.
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鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗原性初步研究
为了研究重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白能否作为群特异性诊断抗原加以应用,将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4核蛋白基因亚克隆于大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组质粒pPROEXTMHT-N.经核苷酸序列测定后,阳性质粒转化大肠杆菌DH5α,并进行诱导表达.表达产物经SD S-PAGE、Western blot鉴定,表明核蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达产物是分子量分别为约56kD和45kD的蛋白,其中分子量为56kD的蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%.包涵体被6mol盐酸胍裂解后,通过镍离子亲和树脂进行了纯化,并用纯化的分子量为56kD的重组蛋白免疫新西兰白兔,所获得的兔抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白多克隆抗体,分别与不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒进行琼脂扩散反应,结果表明 ,该多克隆抗体可与各不同致病型毒株发生反应.这初步表明重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白,可作为群特异性诊断抗原用于该病毒的诊断中.
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探究黄热病毒NS1蛋白在感染早期的诊断价值
为了探讨黄热病毒 (Yellow fever virus, YFV) 非结构蛋白1 (Nonstructural protein 1, NS1) 在感染早期的诊断价值.颅内注射YFV-17D感染乳鼠, 每日处死1窝, 收集抗凝血.Vero细胞和C6/36细胞感染YFV-17D病毒后, 每隔12h收集培养上清.分别采用荧光定量PCR和基于YFV NS1多克隆抗体的双抗体夹心酶联免疫 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 方法检测感染后乳鼠血液、C6/36和Vero细胞上清中YFV的扩增情况和NS1蛋白的分泌规律.乳鼠感染YFV-17D后第2d在血清中即可检测到YFV NS1, 第3d血液中检测到YFV核酸.敏感细胞株在感染YFV-17D后第36h培养上清中可检测到YFV NS1, 而48h后才能检测到YFV核酸.YFV NS1蛋白具有作为YFV感染早期的诊断靶标的潜在价值.
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Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究
为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV) UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中.将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定.用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体.通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白.同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位.结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体.该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础.
关键词： Ⅰ型马立克病毒(MDV) UL24基因 多克隆抗体 鉴定 亚细胞定位 -
马疱疹病毒1型囊膜蛋白gD多克隆抗体制备及亚细胞定位
本研究通过间接免疫荧光技术,确定了EHV-1囊膜蛋白gD单独表达于BHK-21细胞内的亚细胞定位情况,为其亚细胞定位机制及病毒二级囊膜的研究奠定了基础.以EHV-1基因组为模板,利用PCR方法扩增gD部分基因,并构建其原核表达载体pET28-gD,转入BL21(DE3)感受态细胞内进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化gD重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫实验小鼠并制备抗囊膜蛋白gD的多克隆抗体;分别以间接ELISA方法及Western blot方法检测抗体效价及反应性;人工转染pVAX-Kozak-gD重组质粒至BHK-21细胞,利用IF技术对囊膜蛋白gD进行亚细胞定位.结果表明:成功表达了大小约29 kD的gD重组蛋白;制备的多克隆抗体效价为1∶102 400,能较好地与囊膜蛋白gD真核表达产物特异性结合;通过IF方法确定囊膜蛋白gD大部分呈斑点状分布于宿主细胞核周围的胞质中,极少量定位于细胞核内.
关键词： 马疱疹病毒1型(EHV-1) 囊膜蛋白gD 多克隆抗体 亚细胞定位 -
人瘦素放免分析法的建立及初步临床应用
瘦素是由肥胖基因编码, 由脂肪细胞合成和分泌的一种亲水性激素蛋白.本文用高纯的重组人瘦素抗原免疫家兔, 得到高效价的兔抗人瘦素多克隆抗体, 氯胺-T法制备125I-瘦素标记物, 建立人血清瘦素RIA.本方法特异性强, 灵敏度较高, 精密度较好, 其测定值与Linco公司的放免药盒有很好的一致性.用本法建立的正常参考值(BMI 18-25): 男性(34例)为2.15±1.46ng/mL,女性(36例)为7.86±3.60ng/mL.将112名健康者的检测结果分成男、女两组, 血清瘦素值与BMI之间有明显的正相关(r=0.72,P＜0.001).瘦素水平与年龄之间无明显相关性(P＞0.05).女性的促黄体激素、促卵泡激素、泌乳素、孕酮和雌二醇与瘦素无明显相关性(P＞0.05).而对于男性, 睾酮与瘦素水平成明显的负相关(r=0.792,P＜0.01).
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人CPNE5多克隆抗体的制备
制备人CPNE5的多克隆抗体.将CPNE5基因中423bp(626-1048bp)的片段构建到原核表达载体pGEX-5X-1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达蛋白,经SDS-PAGE分离纯化得到抗原肽段,质谱法鉴定后常规免疫家兔.用CL-4B柱纯化抗体.结果显示,成功表达并纯化了人CPNE5抗原肽段；ELISA显示抗血清具有高亲合性,Western blot检测表明抗体能特异性识别CPNE5.本文制备的抗体经检验证实为高亲合性和特异性的兔抗人CPNE5多克隆抗体.
