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人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的:将以构建的未剪接型x盒结合蛋白1(XBP1u)的原核表达,纯化及人XBPI多克隆抗体的制备.方法:重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni~(2+)-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果:XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1:64 000,免疫印迹结果出现特异Mr 33×10~3 XBPIU条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论:成功表达和纯化人XBPIu蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.
关键词： 未剪接型X盒结合蛋白1 效价 纯化 多克隆抗体 免疫印迹 -
大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备
目的:表达和纯化大鼠腺苷酸转运体(ANT1)蛋白并制备其多克隆抗体.方法:通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni~(2+)-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果:成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10~3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr 32×10~3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.
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GST-Gankyrin融合蛋白的原核表达及抗体制备
目的:为进一步研究在肝癌上过表达的癌相关基因Gankyrin的功能,进行GST-Gankyrin融合蛋白表达载体的构建、原核表达、及抗体制备.方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人肝癌细胞系hepG2中扩增Gankyrin Cdna编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒Pgex-4T2中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌DH-5α,经IPTG诱导获得表达,并将Gankyrin蛋白免疫家兔,经过Western blot检测抗Gankyrin抗体的产生.结果:成功构建了Gankyrin原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,Western blot检测证实获得了抗Gankyrin抗体.结论:成功表达了Gankyrin蛋白并制备了其特异性抗体.
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一个新的人信号识别微粒受体基因APMCF1的克隆、表达和抗体制备
目的: 克隆人类新基因APMCF1,原核表达并制备其特异性多克隆抗体 . 方法: 运用5′末端快速扩增方法,结合Genbank数据库进行电子拼接, 完善APMCF1的5′端序列;利用RT-PCR方法,扩增出APMCF1的蛋白编码cDNA序列,克隆入pGEX-KG中,构建APMCF1的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达后获得了GST-APMCF1融合蛋白,以此融合蛋白为免疫原制备兔抗血清,用Western blot 鉴定抗体特异性. 结果: 通过RACE及电子拼接,完善了APMCF1的5′端序列,其cDNA长度为1745 bp,与鼠信号识别微粒受体β亚基序列同源性较高,染色体定位于3q22.2;克隆了APMCF1 816 bp的开放读框序列并表达了GST-APMCF1融合蛋白. 制备了特异性兔抗GST-APMCF1多克隆抗体. 结论: APMCF1可能是编码人类信号识别微粒受体β亚基的基因. 该分子多克隆抗体的初步制备,为进一步研究APMCF1的功能提供了必要工具.
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移植前诱导抗独特型抗体对小鼠皮肤排斥反应的抑制作用
目的 探讨抗独特型抗体诱导对异品系小鼠皮肤移植排斥反应的影响. 方法 以C57BL/6小鼠脾细胞免疫BALB/c小鼠制备抗同种异品系抗体(Ab1). 将Ab1与KLH交联后，免疫BALB/c小鼠诱导产生抗独特型多克隆抗体(Ab2)，并以之为受体，观察Ab2对小鼠皮肤移植排斥反应的影响. 结果 Ab1交联KLH加弗氏佐剂免疫可有效地诱导抗独特型抗体(Ab2)产生. 与对照组相比较，Ab2诱导组小鼠移植物存活时间明显延长. 结论 移植前在受体体内诱导产生以移植物抗原为模拟抗原的抗独特型抗体，可对移植排斥反应产生有效的抑制作用.
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葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用
目的 制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体,并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选.方法 用葎草花粉变应原浸液免疫兔,获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清,应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体.同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测.结果 兔抗血清效价经ELISA检测,效价＞1∶10000,免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线,Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分,分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38ku,患者血清IgG可以识别5种蛋白组分,分子质量分别为100、76、55、49、38ku.结论 制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性,应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似,因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库.
关键词： 葎草花粉 多克隆抗体 Western blotting -
多发性骨髓瘤MMSA-1抗原的二级结构预测及多克隆抗体的制备
目的 运用生物信息学技术研究人多发性骨髓瘤MMSA-1(GenBank:AY952881)基因表达蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,并制备多克隆抗体.方法 应用DNAStar Protean软件提供的模块分析和预测MMSA-1蛋白的二级结构和B细胞抗原表位.采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽,免疫健康新西兰成年家兔,制备相应的多克隆抗体.结果 MMSA-1蛋白含有较多的β折叠和转角结构.综合柔韧性、亲水性、抗原性、表面可能性、二级结构、偶联难易及实验难度等因素,选取了MMSA-1蛋白序列318～333位作为抗原表位,即SSSLLPQSPAPTEHL,15肽合成产物经HPLC纯化和质谱检测,纯度达到98.65%,序列正确.免疫兔子获得血清抗体采用层析柱纯化,ELISA检测效价:1∶6000.结论 本研究为基于人MMSA-1抗原表位手段的免疫治疗研究提供了理论依据.
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抗哇巴因鸡蛋黄抗体IgY的制备
目的 制备出高特异性的抗哇巴因多克隆抗体,为进一步提高内源性哇巴因的检测的敏感性和特异性提供实验基础.方法 采用不同剂量哇巴因-牛血清白蛋白耦联物(0.5 mg/kg;1.0 mg/kg)免疫母鸡,收集鸡蛋;采用聚乙二醇法分离、纯化鸡蛋黄中抗哇巴因抗体;用酶联免疫吸附法检测IgY(yolk immunoglobulin)的抗体效价.SDS-PAGE电泳分析IgY纯度.结果 免疫后1周,鸡蛋黄中可检测出IgY;免疫后6周,鸡蛋黄中IgY的效价迅速升高,高效价达到1:10 240,持续至少4周.结果还显示,大剂量免疫母鸡获得高效价抗体持续时间较长.结论 采用大剂量哇巴因-牛血清白蛋白耦联物免疫母鸡,可以获得较高效价的抗哇巴因IgY.该方法简单,高效价抗体持续时间长,是制备抗体较为有效的方法.
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远缘链球菌细胞分裂蛋白的表达、纯化和抗体的制备
目的:表达与纯化远缘链球菌克隆细胞分裂蛋白(fts K),制备多克隆抗体并鉴定.方法:利用IPTG诱导fts K在大肠杆菌中表达,随后以再生Ni-NTA柱纯化蛋白.纯化后的蛋白多次注射于新西兰大白兔中,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性.结果:获得了纯度较高的远缘链球菌fts K蛋白及其抗体,多抗效价达到1:10000,特异性较好.结论:成功表达了远缘链球菌fts K蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究fts K蛋白功能获取了良好的工具.
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甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 EGF片段多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease-2,MASP-2)EGF功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定,为后续研究奠定基础.方法 利用带有EGF基因片段的pGEX-6P-2原核载体诱导表达GST-EGF融合蛋白,并采用商品化GST-Beads进行纯化;将纯化的融合蛋白作为抗原,与弗氏完全佐剂充分混合后,免疫5周龄BALB/c雌性健康小鼠,制备多克隆抗体;利用琼脂双扩散法检测多克隆抗体的效价,并进一步应用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性及效价.结果 成功表达并纯化EGF蛋白,以此成功制备出特异性强的GST-EGF融合蛋白的多克隆抗体,与其他蛋白无交叉反应;琼脂双扩散法检测的EGF抗体效价为1∶8;Western blot检测的EGF抗体效价大于1∶2 000.结论 成功制备出具有特异性强且效价高的GST-EGF蛋白的多克隆抗体.
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G Ⅱ.17型诺如病毒多克隆抗体的制备及应用
目的 制备兔抗G Ⅱ.17型诺如病毒(G Ⅱ.17 norovirus,G Ⅱ.17 NoV)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)多克隆抗体(兔抗G Ⅱ.17 NoV VLPs多克隆抗体),用其建立组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)-G Ⅱ.17 NoV VLPs阻断试验,并对其进行初步应用.方法 制备并纯化G Ⅱ.17 NoV VLPs,采用SDS-PAGE、电镜观察和粒径检测方法对其进行鉴定.将其免疫家兔制备兔抗G Ⅱ.17 NoV VLPs多克隆抗体,经Western blot对其进行鉴定,并用ELISA检测其效价及特异性.筛选与G Ⅱ.17 NoV VLPs结合力强的唾液HBGA受体类型,优化G Ⅱ.17NoV VLPs质量浓度及多克隆抗体稀释度,用兔抗G Ⅱ.17 NoV VLPs多克隆抗体建立HBGA-G Ⅱ.17 NoV VLPs阻断试验,并进行特异性验证及初步应用.结果 G Ⅱ.17 NoV VLPs经检测纯度为95％,且颗粒形态完整,粒径均一.制备的多克隆抗体在Western blot可见特异性条带,效价可达1∶25 600 000,并对其他基因型(G Ⅰ.2、G Ⅰ.7、G Ⅱ.3、G Ⅱ.4、G Ⅱ.7) VLPs的交叉反应较弱.G Ⅱ.17 NoV VLPs和A、B、0和AB 4种血型的唾液HBGA均能结合,差异无统计学意义(P＞0.05);以G Ⅱ.17 NoV VLPs质量浓度为0.25 μg/mL,多克隆抗体的稀释度为1∶160 000建立了HBGA-G Ⅱ.17 NoV VLPs阻断试验,并应用该方法对不同剂量G Ⅱ.17 NoV VLPs免疫的小鼠血清进行了半数阻断滴度检测.结论 成功制备了高效价兔抗G Ⅱ.17 NoV VLPs多克隆抗体,建立了HBGA-G Ⅱ.17NoV VLPs阻断试验,且该方法特异性良好,可用于G Ⅱ.17 NoV VLPs免疫效果的评价.
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兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定
目的：制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以pGEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒pGEX-6p-1-VP1-N160构建正确；GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35000~55000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达；纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/mL；免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。
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人乳头瘤病毒16型E7密码子优化后的原核表达及免疫原性研究
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16) E7基因密码子优化后的原核表达系统,通过特异性抗体制备评价E7融合蛋白的免疫原性.方法 人工合成优化后的HPV16 E7基因,利用特异引物扩增HPV16 E7基因.将E7基因连接至原核表达载体构建重组表达质粒pMAl-c2X-E7,转化至感受态细胞DE3后,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物E7融合蛋白.纯化后的E7融合蛋白免疫动物,采用ELISA检测动物血清效价.结果 E7基因PCR产物的测序结果与优化后的目的基因序列比对一致.表达的E7融合蛋白经SDS-PAGE分析表明:在相对分子质量50 000处有特异性表达带,与预期相符.以E7融合蛋白制备的多克隆抗体其血清效价可达1∶64 000.结论 成功构建的重组表达质粒pMAl-c2X-E7可有效表达MBP-E7融合蛋白,E7融合蛋白具有良好的免疫原性.
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抗A、抗B血型单克隆抗体试剂稳定剂的筛选研究
临床上使用的抗A、抗B血型定型试剂根据其原材料来源,可分为多克隆抗体(免疫马血清)和单克隆抗体两大类,与多克隆抗体血型试剂相比,单抗血型试剂具有生产成本低、亲合力高等优点,但单抗血型试剂的稳定性欠佳.通过向单抗血型试剂中加入不同配比的稳定剂,观察其对抗A、抗B血型单抗试剂稳定性的影响,筛选出血型单抗试剂佳稳定剂配方,从而提高单抗血型试剂的稳定性.
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多房棘球蚴表面抗原EMY162的原核表达及抗体制备
目的 建立多房棘球蚴表面抗原EMY162原核表达系统及制备兔多克隆抗体.方法 构建表达载体pCzn1-EMY162并转入Arctic Express菌株,用IPTG诱导、Ni柱纯化获得目的蛋白后免疫新西兰兔,以ELISA、SDS-PAGE考察纯化后抗体的效价、浓度及纯度.结果 酶切鉴定和测序结果表明重组质粒pCzn1-EMY162构建成功,且EMY162在包涵体部位中表达、可溶部位微量表达.通过Ni-NTA柱亲和层析纯化获得高纯度的EMY162蛋白.免疫兔后收集血清,其ELISA结果表明,抗血清可以特异性结合目标蛋白,抗体效价大于512 K,SDS-PAGE结果表明,纯化后获得了较高纯度的多克隆抗体,可用于后续实验研究.结论 成功建立EMY162原核表达系统并制备了高纯度、高效价的多克隆抗体.
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用EgAgB8/3重组蛋白ELISA-双抗夹心法建立棘球绦虫感染犬粪抗原检测系统的研究
目的 高纯度表达细粒棘球绦虫抗原B(EgAgB8/3)重组蛋白,制备抗EgAgB8/3重组蛋白的多克隆抗体,建立ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪EgAgB8/3天然抗原系统.方法 对已构建好的pET32a-EgAgB8/3-E.coli BL21 (DE3)Lys S原核细胞表达系统进行IPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平.目的 蛋白用His-Binding-resin 纯化柱进行纯化并免疫动物,免疫血清总IgG采用硫酸铵沉淀法纯化,一部分总IgG用过碘酸钠法进行标记,另一部分作为固相载体结合抗体备用.以未标记的总IgG为ELSA-双抗夹心法的包被抗体,细粒棘球绦虫感染犬粪粗提蛋白为夹心抗原,以标记的IgG为终底物.结果 成功获得高纯度EgAgB8/3重组蛋白和高效价多克隆抗体,运用标记和非标记IgG建立的ELSA-双抗夹心法对棘球绦虫感染犬粪特异性抗原检测的敏感性和特异性分别为85.0%和95.7%.结论 获得的EgAgB8/3重组蛋白具有较好的免疫原性,且免疫动物后制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性.用EgAgB8/3重组蛋白ELSA-双抗夹心法粪抗原检测系统的成功建立为棘球绦虫感染犬快速诊断试剂盒的制备提供了科学依据,此方法的稳定性和推广实用性将需用大量的流行病学调查资料进一步证实.
关键词： 棘球绦虫 EgAgB8/3重组蛋白 多克隆抗体 ELISA-双抗夹心法 -
抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定
目的:制备抗泡球蚴18(Em18)抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法:表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果:免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论:获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.
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应用及拮抗血管内皮生长因子影响骨折愈合的病理观察
血管生成在骨折愈合过程中起着极其重要的作用,血管内皮生长因子(VEGF)作为一种特异性促血管内皮细胞增生及血管生成因子,对正常生理及病理过程中的血管再生起着关键性作用.为探讨VEGF在骨折愈合过程中的作用,笔者采用新西兰大耳白兔左侧桡骨骨折模型,观察分别应用VEGF及其多克隆抗体对骨折愈合的影响.
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人瘢痕组织中钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶的表达
1 对象与方法1.1 主要试剂和仪器兔抗人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)多克隆抗体、兔抗人β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物盒标记的山羊抗兔多克隆抗体、增强型化学发光(ECL)试剂盒(美国Santa Cruz公司),二辛丁酸试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司),聚偏二氟乙烯膜(美国Millipore公司).酶标仪(奥地利Anthosht公司),电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司).
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大鼠烫伤后早期转化生长因子β1/Smads信号通路的活化
1材料与方法1.1 主要试剂来源一抗:小鼠抗大鼠β肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司),山羊抗大鼠磷酸化Smad 2/3多克隆抗体、兔抗大鼠Smad 3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔或山羊多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体(美国Calbiochem公司).
