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星状病毒分子生物学研究进展
星状病毒(Astrovirus)首次于1975年由Appleton和Higgins用电镜检测胃肠炎患儿粪便标本时发现,由于电镜下病毒颗粒呈星形,因此被Madeley和Cosgrove命名为星状病毒.对志愿者和自然感染者的研究均证实星状病毒与腹泻密切相关.世界各地均已有星状病毒感染的报道,既可散发也可以引起暴发流行,亦可引起医源性感染.与轮状病毒相似,星状病毒感染多发生在2岁以内尤其是1岁以内的婴幼儿.住院腹泻患儿中星状病毒检出率为2.5%~9.0%,目前认为星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因,仅次于轮状病毒.此外,老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群,人类免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道.星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一[1].应用多克隆抗体和单克隆抗体,可将星状病毒划分为7个血清型(serotype)HastV-1~HastV-7,近数据库中又报道了血清型8(HastV-8).Noel等[2]将星状病毒分为7个基因型(genotype),并且证明这7个基因型与血清型的划分是一致的.
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小鼠PTA1/CD226分子参与杀伤性T细胞(CTL)的分化
目的阐明小鼠PTA1(mPTA1)/mCD226对杀伤性T淋巴细胞(CTL)分化的影响.方法 构建小鼠PTA1-hIgFc真核表达载体,表达并纯化mPTA1融合蛋白,免疫家兔,获得抗mPTA1的多克隆抗体,并用偶联mPTA1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体.间接免疫荧光染色后经流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性.通过混合淋巴细胞培养(MLC)诱导产生CTL效应细胞,以51Cr释放试验检测mPTA1多克隆抗体在MLC中对T淋巴细胞分化及杀伤功能的影响.结果获得了mPTA1-hIgFc融合蛋白和针对mPTA1胞膜外区的多克隆抗体,该抗体能与转染细胞表面天然mPTA1分子结合.mPTA1多克隆抗体对MLC诱导的CTL的杀伤有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系,mPTA1多抗加入的时间愈早,抑制杀伤作用的效果愈明显.结论抗小鼠PTA1的多克隆抗体可在小鼠混合淋巴细胞培养中明显抑制CTL的分化.
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新疆出血热病毒截短糖蛋白的原核表达及抗体制备
目的:原核表达纯化新疆出血热病毒79121毒株糖蛋白截短片段( Gn、Gc1和Gc2)并分别制备其多克隆抗体。方法采用反转录PCR的方法克隆79121毒株Gn、Gc1及Gc2基因片段,并将其构建到原核表达载体pET-28a(+)中,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化Gn-His、Gc1-His及Gc2-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量( Mr )。用纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性。结果双酶切鉴定和测序证实构建的pET-28a-Gn、pET-28a-Gc1和pET-28a-Gc2重组表达载体正确,表达的融合蛋白Gn-His、Gc1-His和Gc2-His其Mr 分别约为25×103、33×103和34×103。 ELISA法检测抗体效价分别为1∶25600、1∶6400及1∶25600。 Western blot结果表明兔多克隆抗体均能特异性识别相应的重组蛋白。结论新疆出血热病毒截短糖蛋白的表达纯化和效价高、特异性好的兔抗血清的制备,为新疆出血热病毒的检测和糖蛋白生物学功能的深入研究提供资料。
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肺炎支原体P1重组蛋白多克隆抗体与单克隆抗体的制备与比较
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人类原发性非典型肺炎及其他呼吸道感染性疾病的常见病原微生物,不做病原学检查,很难将Mp与其他病原体引起的呼吸道感染相区别.本研究利用具有抗原特异性的重组P1抗原,研制特异、敏感的抗体,为建立临床标本的Mp抗原诊断方法奠定了基础.
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登革病毒3型E蛋白的原核表达及抗体的制备
目的 原核表达并纯化登革病毒3型(DENV-3)E蛋白,并用于制备其抗体.方法 采用PCR技术克隆DENV-3 E蛋白基因,插入原核表达质粒载体pET-32a(+),转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经纯化后,免疫家兔,制备DENV-3 E蛋白抗血清,并用于Westernblot鉴定.同时,采用ELISA测定其抗体效价,并初步应用于DENV-3的检测.结果 重组表达载体经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为65×103,主要以包涵体形式表达;用纯化的包涵体蛋白免疫家兔后,获得的特异性抗血清效价为1∶20 480,该血清可与DENV-3发生特异性反应.结论 本研究原核表达并纯化了DENV-3 E蛋白,制备了高滴度的特异性兔抗血清.制备获得的DENV-3 E蛋白抗体可用于登革病毒的鉴定,为登革病毒相关研究奠定了基础.
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HSV-1衣被蛋白UL7基因的克隆及其在病毒增殖中的表达分析
目的:原核表达并纯化单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL7蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,初步分析UL7蛋白在HSV-1增殖过程中的表达特点。方法 PCR方法扩增UL7基因,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-UL7,转化到E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得并纯化GST-UL7重组蛋白,将其作为抗原免疫ICR小鼠制备抗UL7多克隆抗体。间接法ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性,使用该多克隆抗体对HSV-1病毒感染Vero细胞后不同时间点的UL7蛋白表达量进行检测。结果 GST-UL7重组蛋白在E. coli BL21( DE3)中高效表达,间接法ELISA检测抗UL7抗体效价可达1∶105以上。 Western blot试验证明抗UL7多克隆抗体可以特异性识别UL7蛋白。在HSV-1病毒感染Vero细胞后的不同时间点均检测到了UL7蛋白的表达。结论成功获得GST-UL7融合蛋白,且制备了抗UL7蛋白的多克隆抗体,利用该抗体初步确定了UL7蛋白在HSV-1增殖过程中的不同时间点均有表达。
关键词: 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) UL7 原核表达 多克隆抗体 -
肝细胞癌标志物GPC3表位肽抗体制备及其特性测定
目的 研制针对肝细胞癌标志物磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的高特异抗体.方法 用Biosun软件预测和分析GPC3的抗原表位肽,人工合成选定的表位肽,与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰大白兔制备抗血清.以抗原亲和层析法制取高纯抗GPC3抗体,对肝癌细胞株HepG2和胎盘组织进行Westem blot印迹及对肝癌组织切片进行免疫组化染色,并用夹心ELISA对肝癌患者的血清进行了检测.结果 选定并合成两条抗原表位肽(命名为GPC3-P1和GPC3-P2),取得高效价抗血清(分别为1:204 800和1:409 600).两种抗GPC3抗体纯度均达到95%以上,在Western blot印迹能特异性地检测到GPC3;在免疫组化染色中均与肿瘤组织GPC3特异性结合,在正常组织中没有染色;夹心ELISA可以检测到肝癌患者血清中的GPC3.结论 该两种抗GPC3不同表位的高特异抗体可用于研制相关肿瘤检测试剂盒.
关键词: 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 肿瘤标志物 表位肽预测 抗原亲和层析 多克隆抗体 -
单克隆抗体OKT3在肾移植术后排斥反应中应用的护理体会
OKT3是一种鼠源性抗CD3单克隆抗体的强效免疫抑制剂,其临床主要适应症是肾移植术后难治性排斥反应,其他适应症包括:①抗急性排斥反应的初始治疗;②术后预防排斥反应的诱导治疗,尤其是术后早期肾功能延迟性恢复;③选择性用于多克隆抗体治疗期间产生抗马或者抗兔抗体患者的急性排斥反应[1].但是OKT3在临床使用中可能出现诸多的副作用.回顾性分析2004年1月~2007年3月32例术后使用OKT3患者的临床资料,总结护理体会如下.
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人KIAA1199蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定
目的 KIAA1199是一种功能未知的胞浆蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pMAL-C2X和pGEX-5X-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199,分别表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的MBP-KIAA1199融合蛋白和含重组谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白GST-KIAA1199.其中,MBP-KIAA1199融合蛋白经纯化后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;GST-KIAA1199融合蛋白用于检测抗体特异性.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199两个重组质粒构建成功,并获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论 成功制备了KIAA1199抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.
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小鼠 OC-STAMP 蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定
目的 OC-STAMP蛋白是一种功能尚不明确的六次跨膜蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础。方法采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中。经IPTG诱导后,重组质粒pGEX-4T-1/OC-STAMP表达含重组谷胱甘肽转移酶( GST)的融合蛋白GST-OC-STAMP。 GST-OC-STAMP融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。此后应用 ELISA 及Western blot方法鉴定该抗体。结果 pGEX-4T-1/OC-STAMP重组质粒构建成功,并通过原核表达获得达到免疫要求的融合蛋白。免疫所得抗体血清经间接ELISA法、Western blot检测,确定获得了高效价的小鼠OC-STAMP多克隆抗体。结论成功制备了小鼠OC-STAMP抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础。
关键词: 小鼠OC-STAMP GST融合蛋白 多克隆抗体 -
肌钙蛋白Ⅰ(28~110aa)-C复合物的表达纯化及抗体制备
心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)是诊断急性心肌梗死的"金标准"[1-2].心肌损伤时,外周血中90%以上的cTnI以I-C复合物形式存在[3-4],而28~110间的肽段与C形成复合物稳定,我们根据患者血清中cTnI存在形式,通过引物设计构建pGEX4T-3-cTnI(28~110aa)-C原核表达系统,在大肠杆菌中实现cTnI(28~110aa)-C复合物的稳定可溶性高表达.然后,用该融合蛋白抗原制备抗cTnI单克隆抗体及多克隆抗体,为建立检测方法,提高检测灵敏度做前期准备.
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载脂蛋白A5基因原核表达及多克隆抗体的制备
ApoA5是人apoAI-CⅢ-AⅣ基因序列中1个血浆载脂蛋白基因家族新成员~([1-2]).构建ApoA5基因敲除及ApoA5转基因鼠模型研究证实,ApoA5可调节TG水平,是冠状动脉疾病一个独立负危险因子~([3]).
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酶联免疫法测定脂蛋白脂酶的建立与应用
脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是参与血浆脂蛋白代谢的一个关键酶,LPL基因突变,导致LPL缺乏或活性降低,均可表现出不同程度的脂蛋白代谢紊乱,动脉壁上的LPL与动脉粥样硬化的发生发展有一定的相关性[1].LPL在体内分布广泛,研究不同组织细胞中LPL的表达有助于探索LPL生理功能及致病机理.然而LPL含量较低,难以用一般的化学法检测.Kimura等[2]曾用抗LPL的单克隆抗体建立了酶联免疫吸附试验检测LPL,但未广泛应用.我国在应用免疫学方法测定LPL方面也未见有报道.为探寻一种简便、快速、灵敏的检测LPL的方法,制备了兔抗人和鸡抗人LPL多克隆抗体,拟建立ELISA双抗夹心法测定LPL的方法.
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人血小板膜糖蛋白VI胞外区片段的原核表达及多克隆抗体的制备
目的探讨在原核细胞中表达人血小板膜糖蛋白Ⅵ(GPVI)胞外区片段,制备其多克隆抗体.方法采用PCR技术扩增人血小板GPVI胞外区片段123 aa~268 aa的基因序列,构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达.表达产物经亲和层析法纯化及鉴定后,免疫家兔制备多克隆抗体.采用已知单克隆抗体进行ELISA双抗夹心法、Western blot和流式细胞术鉴定其特异性.结果构建的重组质粒经酶切和测序证实序列正确.经诱导表达在相对分子量为4 200处有一条明显融合蛋白条带,Western blot分析证实与预期值一致.所得的抗血清效价为1∶ 128,ELISA双抗夹心法检测表明,所制抗体识别血小板GPVI分子.Western blot和流式细胞术检测结果显示所制抗体可与血小板裂解液中及血小板膜表面GPVI分子发生特异性免疫反应.结论利用原核细胞表达的人血小板GPVI分子胞外区片段能有效地诱发动物产生多克隆抗体,所得抗体与人血小板上GPVI分子特异性结合,为深入研究GPVI分子提供了工具.
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肠易激综合征患者结肠5-HT的分布特点
目的:探讨肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)患者结肠黏膜嗜铬细胞(EC)的分布特点.方法:符合RomeⅡ诊断标准的IBS患者53例,腹泻型27例,便秘型14例,腹泻与便秘交替型12例;活动性溃疡性结肠炎(UC)患者5例作为对照.正常对照组12名.组织切片采用免疫组化的方法,用兔抗人5-HT多克隆抗体,计数一定范围内EC数量进行定量分析.结果:直肠-乙状结肠交界部EC明显多于回盲部(P<0.05).IBS患者直肠-乙状结肠交界部EC明显高于正常对照组(P<0.05),其中腹泻型IBS患者EC明显增加(P<0.01).在活动性溃疡性结肠炎患者,直肠-乙状结肠交界部可见到EC增加,但与正常对照组相比较没有统计学意义.结论:IBS患者,尤其是以腹泻为主的IBS患者,直肠-乙状结肠交界部EC明显增加.
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胃癌与癌前病变CdX2基因蛋白表达的意义
目的:研究胃癌、胃黏膜异性增生组织中肠道特异性分化基因CdX2蛋白的表达及意义,探讨胃黏膜癌前病变癌变的分子机制.方法:应用多克隆抗体ABC免疫组化检测胃黏膜异性型增生36例、慢性浅表性胃炎35例、肠型胃癌30例及未分化型胃癌28例CdX2基因蛋白的表达.结果:CdX2基因蛋白在慢性胃炎中表达均为阴性;重度异型增生(68%)及肠型胃癌组(71%)CdX2蛋白表达阳性率较轻、中度异型增生组(13%,22%)、及未分化型胃癌组(35%)增高,差异有显著意义(P<0.01);但是,CdX2基因表达与胃癌的分期及淋巴结转移无关(P<.05).结论:CdX2基因过度表达与胃黏膜上皮细胞异型增生的形成及癌变有关,可能是胃癌发生的早期事件,特别是与肠型胃癌的形成关系密切.
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COX-2与Hmlh1、Hmsh2在大肠癌中表达的相关性研究
目的:研究大肠癌及其癌旁正常组织中COX-2、hMLH1、hMSH2的表达情况及其与临床病理参数的关系,并探讨其相关性.方法:应用COX-2、hMLH1、hMSH2多克隆抗体,采用免疫组化方法(SP法)检测78例大肠癌手术切除标本及其癌旁正常组织中COX-2、hMLH1、hMSH2蛋白的表达情况.结果:在采用免疫组化方法所检测的78例大肠癌及其癌旁正常组织中,COX-2的阳性表达率分别为74.36%(58/78)、0%,hMLH1的阴性表达率分别为29.49%(23/78)、0%,hMSH2的阴性表达率为28.21%(22/78)、0%.结论:在大肠癌中,COX-2蛋白表达与hMLH1、hMSH2蛋白的表达缺乏有相反关系,即COX-2蛋白表达阴性的病例中,大多存在hMLH1或hMSH2蛋白表达缺乏,错配修复酶缺乏主要发生在COX-2蛋白表达阴性的病例中.说明二者可能通过不同的途径参与了结肠癌的发生和发展.
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砷剂对实验性鼠肝癌血管生成的影响
目的:研究三氧化二砷(As2O3)对大鼠体内实验性肝癌的治疗作用及其作用机制.方法:选择健康成年封闭群♂ SD大鼠(2月龄),以含0.5g/L2-乙酰氨基芴(2-FAA)进行喂饲制备大鼠肝癌模型.治疗组以两种浓度的As2O3溶液与复方苦参分别注射于大鼠腹腔,1次/d,2 wk后改为2次/wk,总给药时间为4 wk;同时设生理盐水对照组(NS).治疗4 wk末处死大鼠,获取肝脏组织和血清;称肝湿重;记录肝表面肿瘤结节分布情况;肝肿瘤组织HE染色后在光镜下观察肝脏组织形态学变化;流式细胞仪检测肿瘤细胞动力学变化;并分别应用VEGF多克隆抗体和FⅧRAg多克隆抗体染色的免疫组化方法检测致癌组织的血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)表达情况;并测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)及总胆红素(TBi)和结合胆红素(DBi)水平.结果:As2O3治疗组,肝肿瘤结节明显少于生理盐水对照组,尤以中剂量As2O3治疗组表现为显著(P<0.01).免疫组化显示As2O3治疗组VEGF表达强度及相应的MVD明显低于生理盐水对照组(P<0.001).复方苦参和生理盐水对照组上述各项指标相比差异无显著性(P>0.05).各治疗组的血清AST活性明显低于生理盐水对照组(P<0.05),但各组之间无显著性差异(P>0.05);血清ALT、TBi及DBi水平各组之间以及与生理盐水对照组差异均无显著性(P>0.05).结论:As2O3对大鼠肝细胞肝癌生长具有明显抑制作用,并且对肝功能又无明显毒副作用.作用机制可能与抑制VEGF合成间接抗肿瘤血管形成有关.复方苦参无明显治疗作用.
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黄芪对豚鼠哮喘模型血红素氧合酶-1表达的作用研究
本研究利用豚鼠哮喘模型观察血红素氧合酶-1(HO-1)的表达特点及黄芪对HO-1表达的影响. 材料和方法雄性豚鼠30只,体重200~350 g,随机分为5组,每组6只. 腹腔内注射10%卵清蛋白(OVA)溶液1 ml致敏,2周后喷入1% OVA溶液激发30 s,对照组则喷入生理盐水30 s.A组(正常对照组):喷雾生理盐水,每日1次,共2周;B组(哮喘发作1周组 ):每日激发哮喘1次,共1周;C组(哮喘发作2周组):处理同B组,共2周;D组(黄芪治疗1周组 ):每日激发哮喘1次,每次于激发哮喘后30 min腹腔注射黄芪注射液5 g/kg,共1周;E组(黄芪治疗2周组):处理同D组,共2周.各组于后1次激发后6 h采血,测全血碳氧血红蛋白(C OHb)的%含量.取肺做切片,做常规HE染色计数嗜酸性粒细胞(EOS),免疫组化染色选用羊抗 HO-1多克隆抗体.利用计算机图像分析测定豚鼠气道上皮HO-1阳性表达的平均吸光度.以 SAS统计软件进行方差分析.
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阿托伐他汀对血管平滑肌细胞PKB信号转导途径的影响
1材料与方法主要材料:阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司),羟甲戊酸(Mevalonate,MVA,Sigma公司),鼠抗兔PKB/AKT多克隆抗体(Sant Cruz公司),蛋白A-琼脂糖(Amersham公司),γ 32PATP(北京亚辉公司),组蛋白H2B(Histon H2B,BM公司).细胞培养与计数:采用贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞.取生长状态良好的第5~6代血管平滑肌细胞(VSMC)制成细胞悬液(4×104/m1),接种于24孔细胞培养板中,每孔L0.5ml,孵育24h,换无血清培养液继续培养24h后,加10%胎牛血清,同时分组加入阿托伐他汀(1umol/L)、阿托伐他汀(1umol/L)+MVA(250 umol/L),培养3 d后计数.