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人KIAA1199蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定
目的 KIAA1199是一种功能未知的胞浆蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pMAL-C2X和pGEX-5X-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199,分别表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的MBP-KIAA1199融合蛋白和含重组谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白GST-KIAA1199.其中,MBP-KIAA1199融合蛋白经纯化后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体；GST-KIAA1199融合蛋白用于检测抗体特异性.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199两个重组质粒构建成功,并获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论 成功制备了KIAA1199抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.
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小鼠 OC-STAMP 蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定
目的 OC-STAMP蛋白是一种功能尚不明确的六次跨膜蛋白，通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础。方法采用PCR技术扩增出目的基因，将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中。经IPTG诱导后，重组质粒pGEX-4T-1/OC-STAMP表达含重组谷胱甘肽转移酶（ GST）的融合蛋白GST-OC-STAMP。 GST-OC-STAMP融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。此后应用 ELISA 及Western blot方法鉴定该抗体。结果 pGEX-4T-1/OC-STAMP重组质粒构建成功，并通过原核表达获得达到免疫要求的融合蛋白。免疫所得抗体血清经间接ELISA法、Western blot检测，确定获得了高效价的小鼠OC-STAMP多克隆抗体。结论成功制备了小鼠OC-STAMP抗体，为进一步研究基因功能奠定了基础。
关键词： 小鼠OC-STAMP GST融合蛋白 多克隆抗体 -
人血管抑制因子vasostatin片段在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性检测
目的:克隆表达人vasostatin片段,纯化目的蛋白并检查活性,以研究人血管抑制因子vasostatin片段的活性区域.方法:重组构建人vasostatin片段和谷胱甘肽S转移酶(GST)融合表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.通过GST亲和凝胶纯化目的蛋白,用凝血酶(Thrombin)酶切纯化产物获得单体vasostatin片段,并采用MTT法检测其抑制内皮细胞增殖活性.结果:表达产物主要以包涵体形式存在,改变诱导条件可增加可溶性表达量,包涵体形式的表达量约占菌体蛋白总量的55%.活性试验表明,各GST-vasostatin片段和vasoatatin片段具有程度不同的抑制bFGF诱导的内皮细胞增殖的活性,其中以片段vasostatin氨基酸135-164的抑制活性为显著.结论:人vasostatin片段中氨基酸135-164是抑制内皮细胞增殖活性较强的片段.
关键词： vasostatin片段 GST融合蛋白 血管生成抑制 -
A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达
目的:设计针对A组β溶血性链球菌M1和M12蛋白的复合多肽；构建含M蛋白基因(emm基因)1型和12型特异性抗原决定簇基因及其保守区J14肽基因的GST标签的重组表达载体;并诱导和优化GST融合蛋白的表达.方法:在NCBI Genebank和Olig0 6引物设计软件中选择分别编码M蛋白emm基因1型和12型信号肽后35个氨基酸及其相同的保守区14肽基因序列(全长270 bp),通过重叠PCR(Overlap PCR)合成所需的核苷酸序列,经测序确定序列完全和设计的相匹配后,将该重组片段克隆到pGEX-4T-1表达载体中,阳性克隆经双酶切和测序鉴定正确后建立稳定表达该重组质粒的大肠杆菌BL21株系(pE/B)；通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色和Western blot来检测在不同时间(O、2、6、8、18和24小时)和温度(25℃、30℃和37℃)以及不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白(GST/emm)表达情况,并对诱导表达的GST/emm切胶进行质谱分析鉴定.结果:成功构建含有emml和emm12抗原决定簇及M蛋白保守区J14肽基因的原核表达载体；并诱导其稳定表达,在1 mol/L IPTG诱导6～8小时达高峰,不同温度下均有过量表达；质谱检测诱导蛋白GST/emm条带结果正确.结论:成功构建A组p溶血性链球菌的emm1型和emm12型原核表达载体,并稳定诱导GST/emm表达,为下一步研究GST/emm的纯化、酶切以及免疫原性的鉴定和疫苗研制打下夯实的基础.
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类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达
目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测序鉴定获得重组质粒.将重组质粒转化E.coli BL21,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST- SUMO3的融合蛋白,并纯化获得相对分子质量为38 000的融合蛋白.结果:通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,确定了重组质粒pGEX-4T-1/SUMO3中包含有312 bp的小片段,并测序鉴定该插入片段序列与SUMO3序列一致；在终浓度为0.1 mmol· L-1的IPTG诱导时,GST- SUMO3的融合蛋白也被成功地表达和纯化.结论:成功地制备和纯化了类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白,为SUMO3多克隆抗体的制备提供了抗原基础,同时也为SUMO3及SUMO第二类家族功能的深入研究提供了保证.
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人颗粒酶B基因的克隆、蛋白纯化及表达分析
TIL具有抗肿瘤的活性,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了重要的作用.本实验拟扩增GrB全序列,构建GrB的原核表达载体,从而建立其原核表达体系,获得高效表达的重组GrB,纯化蛋白.用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞,并抽提RNA,RT-PCR方法获得GrB的全长,并重组到pGEX-4T-1中,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定,IPTG诱导pGEX-GrB转化的BL21菌,大量纯化表达产物,并通过SDS-PAGE、Western blot分析表达产物,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用.结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段,GrB准确克隆入pGEX-4T-1,成功的构建pGEX-GrB,经诱导表达出与GST融合的蛋白,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带,并能与GrB特异性抗体结合.体外实验表明,GrB能抑制Hep2细胞的增殖.成功构建了pGEX-GrB,并成功表达、大量纯化GrB蛋白,其能够抑制Hep2细胞的增殖.
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UGRP1蛋白的表达、纯化、抗体制备及亚细胞定位
目的 子宫球蛋白相关蛋白1(UGRP1)是一种功能未知的分泌蛋白.通过表达、纯化蛋白、制备抗体及其在组织中表达的研究,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从人胎肺组织中克隆得到UGRP1基因,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/UGRP1.将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的GST-UGRP1融合蛋白.此融合蛋白经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体.用Western 印迹的方法检测多抗血清.通过构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的EGFP-N2-UGRP1载体,转染非洲绿猴肾细胞(COS细胞)表达重组蛋白,对UGRP1的表达进行亚细胞定位.结果 成功构建了pGEX-5X-1/UGRP1载体,获得了高纯度的重组蛋白和多克隆抗体.免疫组化分析表明UGRP1表达于肺支气管上皮细胞,亚细胞定位分析证实UGRP1主要表达于细胞浆.结论 研究发现UGRP1表达于肺支气管上皮细胞和在COS细胞的胞浆中表达.经纯化获得蛋白并制备抗体,为进一步研究UGRP1的功能奠定了基础.
关键词： 子宫球蛋白相关蛋白1 GST融合蛋白 多克隆抗体 亚细胞定位 -
NADH-细胞色素b5还原酶突变型蛋白的结构与功能研究
目的 探讨NADH-细胞色素b5还原酶基因突变引起遗传性高铁血红蛋白血症的分子病理机制,研究突变型(b5R)蛋白结构和功能的关系.方法 用基因重组技术将野生型和突变型(L72P)b5R cDNA克隆于pGEX-2T载体,在大肠杆茵BL21中诱导表达.Western印迹鉴定表达的蛋白为GST-b5R融合蛋白.应用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析,还原型谷胱甘肽洗脱得到纯化的GST-b5R和GST-b5R L72P融合蛋白,比较GST-b5R和GST-b5R L72P酶活性.结果 突变型酶活性低,为野生型的3%.结论 L72P突变可引起蛋白质二级结构改变从而导致酶的活性下降.
关键词： NADH-细胞色素b5还原酶 原核表达 GST融合蛋白 亲和层析 -
胸腺素α1-胸腺五肽在大肠杆菌中的表达及表达条件优化
目的:探讨胸腺素α1-胸腺五肽(Tα1-TP5)在大肠杆茵中的表达及表达条件优化.方法:将化学合成的Tα1-TP5基因与原核表达栽体pGEX-4T-1融合并转化至E.coli BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间等条件对融合蛋白表达量的影响.融合蛋白经GST琼脂糖珠亲和色谱纯化及重组肠激酶切割后,电喷雾质谱鉴定Tα1-TP5.结果:选用TB培养基,在菌体对数生长中后期加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG,37℃诱导5h,GST融合蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的35.8%,且主要以可溶形式表迭.Tα1-TP5的分子质量与理论值相似.结论:Tα1-TP5成功在E.coli中表达,并确定了佳表达务件.
关键词： 胸腺素α1-胸腺五肽 胸腺融合肽 GST融合蛋白 大肠杆菌 表达条件 -
多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测
目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E. Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测.方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2.重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白.对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化.然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析.结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经Western印迹得以验证.反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰.结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性.
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人肌球蛋白调节性轻链的原核表达及纯化
目的：构建pGEX-MLC2重组质粒，在大肠杆菌中表达并纯化谷胱甘肽硫转移酶（ GST ）-MLC2融合蛋白，以用于MLC2抗体的制备。方法：从人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA，通过RT-PCR获得人MLC2 cDNA全长开放读码框架（open reading frame， ORF），并将其重组于原核蛋白表达质粒pGEX-6P-1中，经限制性内切酶和DNA测序鉴定，将该重组质粒转化大肠杆菌E．coli BL21，用异丙基β-D-硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达 GST-MIC2融合蛋白后，进行 Western blotting 分析，鉴定 GST-MLC2蛋白；通过 Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白，并用SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白的纯度。结果：人乳腺癌MCF-7细胞MLC2的RT-PCR产物为535 bp，符合预期；重组质粒pGEX-MLC2经BamHI和EcoRI双酶切出现特征性的525 bp片段；DNA测序证实MLC2全长ORF序列正确无误。 IPTG诱导表达的GST-MLC2融合蛋白分子质量约为46.6 kDa，纯化后其蛋白纯度约95％，经Western blotting 分析表明诱导表达的蛋白是GST-MLC2融合蛋白。结论：人MLC2蛋白原核表达质粒的构建、GST-MLC2融合蛋白的表达和纯化，为MLC2抗体的制备及MLC2功能的深入研究奠定了基础。
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结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定
目的 构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达.方法 以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析；将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析；用western-blot鉴定融合蛋白的表达.结果 正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确；载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白；该蛋白能与GST抗体结合.结论 成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础.
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以蛋白质磷酸酶CDC25A/B为靶标的抗癌药筛选体系的构建
目的 通过克隆和表达人蛋白质磷酸酶CDC25A/B融合蛋白,探讨构建高通量靶向抗癌药筛选体系的途径.方法 采用RT-PCR技术克隆人CDC25A/B催化区结构域cDNA序列,构建pGEX-4T-1-CDC25A/B原核表达质粒,表达和纯化携带还原型谷胱甘肽(GSH)标签的融合蛋白.以对硝基苯基磷酸盐(pNPP)为底物,在96孔板上建立分别以GST-CDC25A/B为靶标的筛选体系,应用维生素K3(VK3)进行验证性抑制剂筛选.结果 成功表达和纯化了GST-CDC25A/B融合蛋白,建立了相应的高通量磷酸酶抑制剂筛选体系.在相同反应条件下,GSTCDC25B对pNPP的水解活性是GST-CDC25A的6倍.VK3对CDC25A/B的半数抑制浓度(IC50)分别为0.8和1.8μg/ml.结论 通过表达和纯化CDC25A/B催化区结构域与GST的融合蛋白,可以高效率的建立靶酶抑制剂高通量筛选体系,为进一步研发VK3衍生物类新型靶向抗癌药奠定了基础.
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UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化
目的 构建 UHRF2 各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定.方法 以 pCMV-3xFlag-UHRF2 为模板,PCR 扩增 UHRF2 的各个结构域基因片段,各 PCR 产物经酶切后连接到 pGEX-4T-1 载体上;将重组载体转化大肠埃希菌 (BL21菌株),IPTG 诱导表达各 GST 融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B(glutathione sepharose 4B) 亲合纯化;纯化的蛋白经 SDS-PAGE 电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况.结果 成功构建了 UHRF2 结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确.结论 UHRF2 各结构域突变体的成功构建便于用 GST pull-down 实验研究 UHRF2 参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2 功能打下了基础.
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小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备
目的 克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体.方法 以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamHⅠ和NheⅠ双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔, 制备Klotho多克隆抗体.结果 表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15 %左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1∶ 10 000,Western印迹分析验证了抗体特异性.结论 GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础.
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GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究
将构建好的可表达GST融合蛋白的重组病毒AcMNPV-OCC--GST-6xHis-Etp28感染Sf9细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行SDS-PAGE分析,结果显示53kDa的融合蛋白(GST-6xHis-Etp28)呈不溶状态.在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠至终浓度1.5%,并将Triton X-100的比例由1%提高到2%.SDS-PAGE结果显示至少有1/3的GST-6xHis-Etp28处于溶解状态,可溶性GST-6xHis-Etp28经亲合层析,53kDa的目标蛋白得到纯化.
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人卵透明带重组融合基因及其表达载体的构建
目的 构建人卵透明带蛋白3(zona pellucida 3,ZP3)/GST蛋白融合基因原核表达载体.方法 利用PCR法扩增出去N端的信号肽和C端的跨膜区huZP3成熟蛋白编码基因.先将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析,然后将huZp3核心DNA片断克隆入GST蛋白融合原核表达载体pGEX4T-1内.结果 获得一个核苷酸长度约为1000 bp的基因,与GenBank(NCBI:M60504)公布的Zp3基因序列有99%的同源性,DNA序列分析发现,有一个氨基酸出现变异.酶切鉴定后证明ZP3基因完整插入GST融合蛋白原核表达载体pGEX4T-1中.结论 成功构建出含ZP3基因的GST融合蛋白原核表达载体.
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039 HEV抗体检测方法的比较
对戊型肝炎病毒(HEV)进行血清学检测,早期的血清学检测局限于免疫电镜方法,特异性虽好但较为繁琐,而用HEV重组抗原进行检测,结果极佳.现在许多实验室所用的方法是用HEV不同的表达蛋白质作抗原来检测.有代表性的是NIH和GL两个实验室以表达在昆虫细胞内的分子量为55kD的ORF2外壳蛋白和ORF2或ORF3表达在E.Coli中的GST融合蛋白作抗原,用ELISA法检测抗HEVIgM和IgG.
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两条肿瘤靶向抑制肽的修饰及作用靶点的初步研究
目的 探讨两条肿瘤靶向抑制肽(QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS)经化学修饰后(N端乙酰化、C端酰胺化)的稳定性,并初步探讨其作用靶点.方法 3H-TdR掺入法、CCK-8法分别探讨多肽修饰前后对A549细胞增殖、活力的影响;高效液相色谱法(HPLC)测定多肽在10％血清条件下,不同时间点(12、24 h)的剩余量,评价其修饰前后在血清中的稳定性;构建GST标签的多肽(GST-多肽)融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中诱导表达、纯化;免疫共沉淀法鉴定GST-多肽融合蛋白能否与VEGFR-1、VEGFR-2结合.结果 多肽RKRKRKKSRYIVLS经化学修饰后在10％血清环境下对A549细胞增殖的抑制率由(2.63±6.19)％提高至(48.50±7.14)％(P＜0.01),对A549细胞活力的抑制率由(1.30±7.90)％提高至(20.80±5.90)％(P＜0.01),24 h后多肽在血清中的剩余量由(56.04±1.81)％提高至(64.64±0.30)％(P＜0.01);多肽QKRKRKKSRKKH化学修饰前后在10％血清环境下对A549细胞增殖的抑制率分别为(28.38±5.63)％、(34.25±10.90)％ (P ＞0.05),对A549细胞活力的抑制率分别为(8.09±5.84)％、(15.07±8.09)％ (P ＞0.05),24 h后多肽在血清中的剩余量由(72.72±2.60)％提高至(77.43％±1.78)％(P＜0.05);免疫共沉淀表明这两条多肽均能与VEGFR-1、VEGFR-2结合.结论 VEGFR-1、VEGFR-2为这两条肿瘤靶向抑制肽的作用靶点;多肽RKRKRKKSRYIVLS、QKRKRKKSRKKH修饰后在血清环境下稳定性明显提高,修饰后的RKRKRKKSRYIVLS对A549细胞增殖及活力的抑制能力明显增强.
关键词： 血管内皮生长因子受体 GST融合蛋白 免疫共沉淀 3H-TdR CCK-8 -
重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化
目的 构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件.方法 用化学合成法合成多价人精子表位肽基因.该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒.将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响.结果 构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体.在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5h.优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2％,且主要以可溶形式表达.结论 成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21 (DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量.
关键词： 重组多价人精子表位肽 GST融合蛋白 大肠杆菌 表达条件
