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北京地区2011-2014年致儿童猩红热A组链球菌emm基因型别变化特征分析
目的 了解北京地区致儿童猩红热A组链球菌(GAS)emm基因型别分布,并探讨其型别变化与猩红热病例的关系.方法 收集2011-2014年5-7月北京市36家医院临床诊断为猩红热病例咽拭子GAS分离菌株,采用PCR联合测序方法对分离菌株进行emm分型,选取中国疾病监测信息报告管理系统中北京市猩红热病例报告数据进行分析.结果 共采集咽拭子标本2 161份,分离GAS菌株762株,阳性率为35.3％(762/2161).检测到7个emm型别,其中emm12型占69.4％ (529/762),emm1型占29.8％ (227/762),其他5种emm型别(11、22、75、89、128)占0.8％(6/762).分析各年份emm型别构成比:2011年emm12型82.2％ (295/359),emm1型16.7％ (60/359),其他型(11、22、89)1.1％(4/359);2012年emm12型77.3％(123/163),emm1型23.9％(39/163),emm75型0.6％(1/163);2013年emm12型50.7％ (38/75),emm1型49.3％(37/75);2014年emm12型44.2％(73/165),emm1型55.2％(91/165),emm128型0.6％(1/165).不同年份emm型别构成比变化的差异有统计学意义(P＜0.001).2011、2012年emm12为主导菌型,2014年主导型别转换为emm1型.2011-2014年报告猩红热病例分别为6 152、2 908、2 048和3 918例,以2011年报告例数多,2014年比2013年报告病例数增加91.31％.2011年GAS分离株emm型别存在年龄差异,其中1～5岁组分离的emm12型高于＞5岁组(P＜0.05).2011、2013年分离GAS菌株存在地区差异,2011年emm1型分离株为城区高于郊区(P＜0.05),2013年emm1型为郊区高于城区(P＜0.05).结论 2011-2014年北京地区GAS菌株优势菌型为emm12和emm1型;不同年份emm12、emm1变换成为主导菌型;emm主导菌型变化与猩红热病例变化趋势有关.
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北京市2015-2017年猩红热及咽部感染患者A组链球菌超抗原基因特征研究
目的 分析2015-2017年北京市猩红热及咽部感染患者A组链球菌(GAS)超抗原基因特征.方法 采集猩红热及咽部感染患者咽拭子标本进行GAS分离鉴定,采用实时荧光PCR法检测超抗原基因(speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、smeZ和ssa),PCR法扩增后测序确定GAS的emm基因型别.结果 2015年5月至2017年7月采集的6 801份咽拭子标本中共分离到377株GAS菌株(阳性率5.5％).超抗原基因speC、speG、speH和speK的检出率3年间出现较明显变化.共检测到45种超抗原基因谱,占比较高的2种超抗原基因谱在emm1和emm12型间分布差异均有统计学意义(x2=38.196,P＜0.001;x2=72.310,P＜0.001).超抗原speA、speH、speI和speJ在emm1和emm12型GAS间分布差异均有统计学意义(x2=146.154,P＜0.001;x2=52.31,P＜0.001;x2=58.43,P＜0.001;x2=144.70,P＜0.001).结论 2015-2017年北京市猩红热及咽部感染患者GAS超抗原基因speC、speG、speH和speK的检出率有较明显变化,speA、speH、speI和speJ在emm1和emm12基因型之间的分布存在差异,GAS菌株所携带的超抗原基因谱更宽,但主要流行谱未发生改变.
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2011年北京市儿童携带A组链球菌的M蛋白基因分型研究
目的 了解2011年北京市儿童携带A组链球菌(GAS)的M蛋白基因(emm)各基因型别分布情况.方法 于2011年5-7月,从北京市36家医院儿科门、急诊中选取猩红热和咽部感染患者作为调查对象,共3315例.采集调查对象咽拭子标本,分离GAS菌株.应用PCR法扩增emm基因,进行测序,确定GAS的emm基因型别,并比较不同人群、不同疾病间的emm基因型别的差异.结果 3315份咽拭子标本中,分离出633株GAS菌株,其中emm基因阳性菌株共610株,故终有610例患者纳入研究,其中,猩红热患者448例(73.4％),咽部感染患者162例(26.6％)；城区397例(65.1％),郊区213例(34.9％)；1～5岁儿童240例(39.4％),6～18岁儿童369例(60.6％).共鉴定出8种emm基因型(猩红热患者:6种,咽部感染患者:4种)和21种emm基因亚型(猩红热患者:16种,咽部感染患者:10种),包括3种新的emm亚型,分别是emm1.63、emm12.62和st5144.20,其中,emm1.63在猩红热和咽部感染患者中均存在,而emm12.62和st5144.20仅见于咽部感染患者.emm12基因型所占比例高,为80.5％ (491/610),其次是emm1,占18.0％ (110/610)；基因亚型中,emm12.00所占比例高,为69.0％ (421/610),其次是emm1.00[16.9％ (103/610)]和emm12.19[6.1％ (37/610)],均是猩红热和咽部感染患者的主要流行菌株.流行菌株的分布在分离地区和宿主年龄上存在差异,郊区患者emm1、emm1.00和emm12.19构成比[分别为22.1％(47/213)、19.2％(40/213)、8.0％ (17/213)]高于城区患者[分别为15.9％(63/397)、15.6％ (62/397)、5.0％ (20/397)],差异有统计学意义(P＜0.05)].emm1.00在6～18岁年龄组构成比[19.2％ (71/369)]高于1～5岁年龄组[13.3％ (32/240)],差异有统计学意义(x2=8.45,P ＜0.05).结论 2011年北京市儿童携带GAS的emm基因型别中,主要流行的基因型是emm12和emm1,主要流行的基因亚型是emm12.00、emm1.00和emm12.19,其分布在分离地区和宿主年龄上存在差异.
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A组链球菌致儿童急性肾小球肾炎病原学研究
目的 研究致儿童急性肾小球肾炎A组链球菌 (GAS) 致病基因及耐药.方法 选取本院2014年1月-2017年6月期间收治急性链球菌感染后肾炎患儿为研究对象.采用微量肉汤稀释法测定小抑菌浓度 (MIC) 对青霉素、红霉素、氯霉素、环丙沙星、四环素、头孢曲松和万古霉素7种临床常用抗生素进行药敏试验.设计emm基因、SpeB基因、NudA基因和NudB基因, 并进行PCR扩增.采用BLAST将产物序列与GenBank中进行同源性比对, 并对结果判读.结果 本次研究中共成功分离出GAS菌株113株, 其中2～6岁71例, 6～11岁42例.GAS分离株未对青霉素、环丙沙星和万古霉素产生耐药性.对红霉素、氯霉素、四环素和头孢曲松耐药率分别为99.12％ (112株) 、90.27％ (102株) 、84.96％ (96株) 和2.65％ (3株) .对单一抗生素耐药为7株 (6.19％), 对两种抗生素耐药13株 (11.50％), 对三种以上抗生素耐药93株 (82.30％) .GAS分型:emm2型6株, emm4型10株, emm12型72株, emm25型3株, emm49型6株, emm57型4株, emm61型12株.113株GAS中, 56株携带Aph3基因 (49.56％), 71株携带Aac6-I基因 (62.83％), 96株携带tetM基因 (84.96％), 113株携带链球菌外毒素B (100％), NudA和NudB各检出61株, 携带率为53.98％.结论 随着广谱类抗生素的应用, A组链球菌感染儿童急性肾小球肾炎日益减少, 但耐药程度越来越高.
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2003—2008年北京儿童医院脓疱疮患儿A组β溶血性链球菌分离株耐药基因检测及emm分型研究
目的 研究北京儿童医院脓疱疮患儿临床分离A组β溶血性链球菌(GAS)及其对抗菌药物的敏感性情况.方法 收集北京儿童医院2003-2008年收治的1735例脓疱疮儿童皮损部位分离出的52株GAS菌株,采用琼脂稀释法测定9种抗菌药物的低抑菌质量浓度(MIC)值;用聚合酶链反应方法对上述菌株进行大环内酯类抗生素耐药基因ermB、ermA和mefA检测以及emm分型情况.结果 分离株对四环素及大环内酯类抗生素耐药率均为100％,MIC＞256mg/L;对青霉素、头孢拉啶及氧氟沙星的敏感率高达100％.大环内酯类抗生素耐药基因emB、ermA和mefA和阳性率分别为92.30％、7.70％和0;分离株的emm分型常见的为emm 12.0 (53.85％),emm1.0 (36.54％).结论 北京儿童医院收治的脓疱疮儿童GAS感染流行菌株对大环内酯类抗生素耐药率很高,主要耐药机制为ermB编码的23SrRNA甲基化酶导致靶位改变,在北京地区青霉素类和头孢菌素类抗生素仍是治疗GAS感染首选药物.
关键词： A组β溶血性链球菌 抗生素耐药 大环内酯类抗生素耐药基因 emm基因 -
A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达
目的:设计针对A组β溶血性链球菌M1和M12蛋白的复合多肽；构建含M蛋白基因(emm基因)1型和12型特异性抗原决定簇基因及其保守区J14肽基因的GST标签的重组表达载体;并诱导和优化GST融合蛋白的表达.方法:在NCBI Genebank和Olig0 6引物设计软件中选择分别编码M蛋白emm基因1型和12型信号肽后35个氨基酸及其相同的保守区14肽基因序列(全长270 bp),通过重叠PCR(Overlap PCR)合成所需的核苷酸序列,经测序确定序列完全和设计的相匹配后,将该重组片段克隆到pGEX-4T-1表达载体中,阳性克隆经双酶切和测序鉴定正确后建立稳定表达该重组质粒的大肠杆菌BL21株系(pE/B)；通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色和Western blot来检测在不同时间(O、2、6、8、18和24小时)和温度(25℃、30℃和37℃)以及不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白(GST/emm)表达情况,并对诱导表达的GST/emm切胶进行质谱分析鉴定.结果:成功构建含有emml和emm12抗原决定簇及M蛋白保守区J14肽基因的原核表达载体；并诱导其稳定表达,在1 mol/L IPTG诱导6～8小时达高峰,不同温度下均有过量表达；质谱检测诱导蛋白GST/emm条带结果正确.结论:成功构建A组p溶血性链球菌的emm1型和emm12型原核表达载体,并稳定诱导GST/emm表达,为下一步研究GST/emm的纯化、酶切以及免疫原性的鉴定和疫苗研制打下夯实的基础.
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北京市猩红热患者 A 组链球菌 M 蛋白基因型别与超抗原基因特征的相关性研究
目的：分析2012年5月至2013年7月北京市猩红热患者A组链球菌（G A S ）超抗原基因特征及其与M蛋白基因（emm基因）型别的相关性。方法采集猩红热患者标本进行GAS分离鉴定，并应用PCR方法检测 emm基因和超抗原基因（speA、speB、speC、speF、speG、speH、speI、speJ、speL、speK、speM、ssa和smeZ）。应用卡方检验比较率和构成比。结果2012年5月至2013年7月分离到的423株GAS菌株进行超抗原基因检测，结果显示 speB、speC、speF、speG、smeZ和ssa的检出率较高，分别达97．6％、99．8％、98．3％、99．8％、94．1％和88．4％，其次为 speH（54．6％）、speI（53．4％）、speA（45．2％）和 speJ（43．5％），而 speK（2．4％）、speL（1．4％）和 speM（1．7％）的检出率较低。GAS菌株主要 emm型别为emm12型（59．5％）和emm1型（37．4％）。 emm12型携带 speH和speI基因的比例高达84．8％和84．0％，而 emm1型仅为4．0％和3．4％；emm12型携带 speA 和speJ基因的比例仅为17．3％和14．8％，而 emm1型为95．3％和94．6％。emm12型与emm1型菌株之间携带基因谱的差异有统计学意义（P＜0．05）。结论2012年至2013年，北京市GAS菌株流行型别以 emm1和 emm12型为主，且emm型别与超抗原基因谱之间存在相关关系。
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2011年-2013年北京市西城区儿童A组溶血性链球菌的emm基因分型
目的 了解2011年-2013年北京市西城区儿童携带A组溶血性链球菌(GAS)的M蛋白基因(emm)各基因型别分布情况.方法 于2011年-2013年每年5月-7月,从北京市西城区辖区内两家医院采集猩红热或咽峡炎及扁桃体炎儿童患者的咽拭子,培养分离获得121株GAS,提取DNA,应用PCR扩增emm基因,进行测序,确定GAS的emm基因型别,并比较不同年度、不同人群、不同诊断病例来源标本基因型别的差异.结果 3年间121份GAS标本中共检测出了3个基因型分别为emm1、emm12、emm75,emm1为24株,emm12为96株,emm75为1株.检出了10个基因亚型,分别为emm12.0、emm12.1、emm12.19、emm12.29、emm12.30、emm12.38、emm1.0、emm1.33、emm1.76、emm75.0.结论 2011年-2013年间北京市西城区儿童携带GAS的emm基因型别中,主要流行的基因型是emm12和emm1,主要流行的基因亚型是emm12.0和emm1.0,且emm1.0有逐年增多的趋势.emm基因型目前在北京西城区人群分布上在性别、年龄、病例诊断类型上无差异.仅在北京市和外省市人群中emm12和emm1的分布有差异(P＜0.05).
关键词： 猩红热 A组溶血性链球菌(GAS) emm基因 -
北京地区2014年儿童A组链球菌emm基因型别分布及药敏特征
目的 了解北京地区儿童A组链球菌(GAS)emm基因型别分布及药敏特征.方法 采用PCR扩增联合测序对2014年5月至7月收集的北京地区16个区县36家医院儿童GAS菌株371株进行emm分型;采用VITEK-2全自动微生物分析系统及GPS-67药敏检测卡检测菌株对10种抗生素(青霉素、氨苄西林、红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星、替加环素、万古霉素、利奈唑胺和链阳霉素)的小抑菌浓度(MIC),依据临床实验室标准化协会(CLSI) 2012年M100-S22判定标准判断其对相关抗菌药物敏感性,计算敏感率(S％)、中介率(I％)、耐药率(R％).结果 共收集371株GAS,测定出5种emm基因型及15种亚型.emml型为主[54.7％(203/371株)],其次emm12型占44.2％(164/371株),其他型别占1.1％(4/371株).选取其中207株GAS进行药敏试验,结果对青霉素、氨苄西林、左氧氟沙星、替加环素、万古霉素、链阳霉素、利奈唑胺敏感率均为100.0％(207/207株);对克林霉素、红霉素和四环素耐药率分别为98.5％(204/207株)、98.1％(203/207株)和92.8％(192/207株);菌株对红霉素、克林霉素和四环素耐药率在不同地区、年龄和临床诊断间的分布差异无统计学意义(P＞0.05).结论 北京地区2014年儿童GAS菌株emm基因型别分布较为集中,呈现以emml和emml2型为主,emml型稍高的分布特点.药敏检测结果显示对青霉素等β-内酰胺类和左氧氟沙星等喹诺酮类药物具有较高敏感性.对克林霉素和红霉素等大环内酯类抗菌药物的耐药水平较高,提示临床应合理选择用药.
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A组链球菌M蛋白二价DNA疫苗表达载体的构建与鉴定
目的构建含A组链球菌M蛋白基因(emm基因)1型和3型特异性抗原决定簇基因的重组质粒.方法用PCR技术从40381137(T1)型和31281187(T3)型A组链球菌中分别扩增emm基因,插入T载体后测序、blast后分别确定为emm1和emm3基因型,再从emm1和emm3基因分别扩增105 bp目的基因,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术将两目的片段连接起来.插入真核表达载体pSecTaqB中,阳性质粒克隆经酶切和测序鉴定.结果从40381137(T1)和31281187(T3)A组链球菌株的基因组成功克隆emm基因,经测序及blast后分别确认为emm1型和emm3型;用pstⅠ和BamH Ⅰ酶切重组质粒pSemm1-3、测序均显示插入正确.结论成功构建A组莲球菌的emm1型和emm3型二价真核表达载体,为下一步研究表达功能及表达蛋白的生物活性打下基础.
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广州市儿童致咽炎β溶血性链球菌的流行情况及其emm基因分型
[目的]了解近期广州市儿童致咽炎β溶血性链球菌(BHS)的流行情况及其emm基因分型。[方法]对我院儿科门急诊1 190例急性咽扁桃体炎的患儿进行咽拭子培养。鉴定为BHS者包括A、B、C和G组溶血性链球菌(group A、B、C、G streptococcal,GAS、GBS、GCS和GGS)进行细菌组DNA的提取；通过PCR扩增emm基因并测序；其结果与NCBI和CDCHome中已知的基因序列进行同源性比对大于95％则认为是同型菌株，藉此确定其分型。[结果]在1 190例符合条件的患儿咽拭子标本中[男：678例，(6.96±2.73)岁；女：512例，(6.70±2.60)岁]，鉴定为BHS的共有46例(3.87％)。其中GAS、GBS、GCS和GGS分别有4例、20例、2例和20例，分别占BHS约8.7％、43.5％、4.3％和43.5％；而GAS、GBS、GCS和GGS的阳性率分别约为0.37％、1.68％、0.17％和1.68％。男患儿BHS的阳性率约为5.01％，女患儿约为2.34％，两组比较(x2=26.431，P＜0.001)有统计学意义。除了GBS外，其他BHS(GAS、GC/GS)均有emm基因表达(1 000～1 500 bp)。经测序共有15型emm，其中4株GAS分别表达emm 1和emm 12(7.69％)。[结论]致咽炎GAS阳性率低于0.5％，而GBS、GGS阳性率接近2％。但GBS无emm表达，GAS表达emm 1和emm 12，而GCS、GGS无明确的emm优势型。
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北京地区儿童A组链球菌感染临床分离株的emm分型研究
目的 了解2015年北京地区分离自呼吸道感染患儿的A组链球菌(GAS)emm型别分布情况.方法 采集2015年5月至7月北京市16个区16家医院儿科门、急诊临床猩红热病例和咽部感染病例咽拭子标本分离的GAS菌株.应用PCR扩增联合基因测序技术,测定emm型别,并比较不同特征组间的emm基因型别差异.结果 从各区医院采集的咽拭子标本中分离247株GAS菌株.其中来自猩红热患儿73株(29.6%,73/247),咽部感染患儿174株(70.4%,174/247).共检测到6种emm基因型,emm12占53.4%(132/247),emm1占44.1%(109/247),其他型别(emm22、emm75、emm131、emm241)占2.5%(6/247).emm型别的分布在不同年龄组间存在差异,且差异有统计学意义(P<0.05),emm1在6~12岁年龄组中的构成比较高,emm12在1~5岁组中构成比较高.emm型别在地区、性别、疾病类型间差异无统计学意义(P>0.05).结论 2015年北京地区儿童A组链球菌的emm基因型中,主要的流行型别为emm12和emm1,其分布不同年龄组间存在差异.
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化脓链球菌致中毒性休克综合征临床分析
目的 了解化脓链球菌致中毒性休克综合征(STSS)的实验室检查特征,为临床诊治和流行病学调查提供参考依据.方法 回顾性分析1例化脓链球菌感染致STSS患者的临床诊治经过和实验室检查数据,对分离株进行emm基因分型,并检测其常见超抗原基因.结果 该患者因左脚趾皮肤溃破致左下肢严重感染,并伴多器官功能衰竭及STSS.伤口分泌物分离出化脓链球菌,对青霉素敏感.分离株为emm 1.1型,携带speA、speC、spek、ssa和smeZ等5种超抗原基因.临床采取清创、负压封闭引流技术(VSD)和青霉素联合克林霉素抗感染等综合治疗,患者痊愈出院.结论 化脓链球菌致STSS可引起严重的临床症状,与其携带多种超抗原基因有关.外科治疗和有效抗感染是保证治疗成功的关键.
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儿童A群链球菌感染的耐药性分析及其emm基因分型
[目的]了解广州地区儿童感染 A 群链球菌(GAS)的耐药情况及emm基因分型. [方法]对所分离的GAS以K-B法进行药敏试验并分析耐药情况;采用PCR法扩增GAS的M蛋白N末端,直接进行测序确定GAS的emm基因分型. [结果]GAS对青霉素、阿莫西林/棒酸、氧氟沙星、头孢菌素和万古霉素敏感.对红霉素、克林霉素、复方新诺明、四环素和氯霉素的耐药率分别为47.1%、42.5%、33.3%、21.8%、18.4%.以emm1基因型为主(37.9%),其次为emm18(13.8%),emm12(11.5%),emm69(9.2%)等. [结论]广州地区儿童感染GAS对大环内酯类等抗菌药物耐药形势严峻,应引起重视;GAS的emm基因型主要为emm1,选择主要流行菌株,可以作为基因疫苗的基础.
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深圳地区儿童A群致病性链球菌感染流行现状及M蛋白基因分型分析
目的：了解深圳地区儿童 A群致病性链球菌（group A streptococcus，GAS）感染流行现状及其 M蛋白基因（emm）分布状况，为该区GAS疫苗的研制提供科学依据。方法收集2014年3月～2015年12月来医院门诊和住院部就诊的急性咽炎、急性化脓性扁桃体炎、风湿热及猩红热患儿的咽拭子及皮肤化脓性感染伤口分泌物共1634例，分别对标本进行细胞培养与鉴定，分析不同年龄儿童 GAS感染流行情况，并对 GAS的 M蛋白 N末端进行 PCR扩增测序，分析 GAS的emm基因分型及其在疾病中的分布情况。结果1634例标本中共分离鉴定出61株 GAS，检出率为3.73％（61／1634），其中学龄前和学龄儿童分别检测出14株和47株，检出率分别为22.95％（14／61）和77.05％（47／61），学龄儿童 GAS感染率明显高于学龄前儿童，两者结果之间差异有统计学意义（χ2＝32.035，P＜0.01），但学龄儿童不同年龄段 GAS感染率之间比较差异无统计学意义（χ2＝1.572，P＞0.05）；GAS 在急性咽炎和化脓性扁桃体炎的患儿中检出率高，分别为34.43％（21／61）和27.87％（17／61）；61株 GAS的 emm基因型以 emml 和 emm12为多见，分别占40.98％（25／61）和29.51％（18／61）。结论深圳地区学龄儿童 GAS感染率明显高于学龄前儿童，且以急性咽炎和急性化脓性扁桃体炎患儿检出率高。61株 GAS感染的 emm基因以emm1和emm12为主，因此，各地加强GAS的emm基因分型研究，可为该区GAS疫苗的研制提供重要的分子流行病学依据。
