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鲍曼不动杆菌外膜蛋白A1S_0115的克隆、表达及免疫保护性研究
目的 构建鲍曼不动杆菌外膜蛋白A1S_0115胞外区(A1S_ 0115A)与GST标签融合表达的原核表达载体,在大肠杆菌XL-1 blue中表达、纯化A1S_0115A蛋白后,进行抗原免疫保护性的初步研究.方法 利用生物信息学技术分析A1S_0115蛋白结构,确定蛋白的胞外区片段,PCR扩增该基因片段后,构建重组表达载体pGEX-6P-2-A1S_0115A,将重组载体转化大肠杆菌XL-1 blue,IPTG诱导表达GST-A1S _0115A融合蛋白,采用GST亲和层析填料纯化并酶切获得A1S_0115A蛋白.利用已建立的Balb/c小鼠鲍曼不动杆菌全身感染模型对该蛋白抗原的免疫保护性进行初步评价.结果 重组质粒经过BamH I和NotⅠ双酶切鉴定、核酸序列测定和IPTG诱导表达及酶切后蛋白的SDS-PAGE分析表明,A1S_ 0115A蛋白胞外区相对分子质量大小约50 000,GST标签相对分子质量大小约26 000,与预期设想符合,目的蛋白纯度在95％以上.用A1S_ 0115A蛋白对小鼠进行2轮次免疫保护性实验及其抗体的被动免疫实验,免疫攻毒后小鼠的保护率分别为50％和55％,被动免疫保护率为45％和50％.结论 成功构建重组表达载体pGEX-6P-2-A1S_0115A,利用大肠杆菌可溶表达系统、GST亲和层析和酶切方法获得了高纯度的A1S_ 0115A蛋白.动物免疫攻毒保护实验结果表明A1S_ 0115A蛋白具有较好的免疫保护性,为研制新型有效的鲍曼不动杆菌疫苗奠定实验基础.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB活性片段的克隆、表达及抗原免疫保护性初步研究
目的 探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原IsdB活性片段(IsdB2)免疫保护作用.方法 利用生物信息学技术预测分析出 IsdB活性片段(IsdB2),PCR扩增编码IsdB2的基因片段,亚克隆至GST标签融合表达的原桉表达载体pGEX-6P-2中,将载体转化入大肠杆菌XL-1 blue,通过IPTG诱导表达IsdB2/GST融合蛋白,利用GST亲和层析初步纯化获取IsdB2蛋白、用IsdB2蛋白抗原辅以氢氧化铝佐剂对小鼠进行免疫实验,统计小鼠存活率对IsdB2抗原的免疫性进行初步研究.结果 重组质粒经过BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切鉴定、核酸序列测定和IPTG诱导表达IsdB2/GST及酶切获取IsdB2蛋白的SDS-PAGE分析表明,IsdB2 蛋白相对分子质量大小约72 000,GST标签相对分子质量大小约26 000,与预期相符合.用IsdB2蛋白对小鼠进行3次疫苗免疫实验,IsdB2对小鼠的保护率分别为84.6％ 、50％和60％.结论 成功构建重组表达载体pGEX-6P -2- IsdB2,利用大肠杆菌表达系统、GST亲和层析和酶切方法获得IsdB2蛋白抗原,通过3次动物疫苗免疫实验结果表明IsdB2具有免疫保护性,为研制新型有效的MRSA疫苗奠定实验基础.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 IsdB活性片段 GST融合蛋白 免疫保护性 -
小鼠Semcap 2分子的克隆、表达与抗血清制备
目的获得小鼠Semeap 2蛋白,并对其功能进行初步研究.方法用DNA重组法构建了mSemcap 2 cDNA的原核表达质粒pGEX-KG-mSemcap 2.将重组质粒转入大肠杆菌DH5α,经0.3 mmol/LIPTG在37℃条件下诱导3.5 h,行SDS-PAGE检测.用8 mol/L尿素溶解的包涵体作为免疫原免疫家兔制备多抗.结果蛋白表达量约占细菌总蛋白的15%.多抗效价达1:102 400,此多抗可以与重组蛋白及真核转染细胞中的蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论小鼠Semcap 2在大肠杆菌中得到高效表达,其抗体的制备为深入研究mSemcap 2提供了材料.
关键词： 小鼠Semcap 2 原核表达 GST融合蛋白 -
肿瘤靶向性RGD-IFN-α2a融合蛋白在原核细胞中的表达与纯化
RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽,作为整合素和其配体相互作用的识别位点,能与肿瘤细胞或肿瘤组织新生血管特异性高表达的某些整合素如αV β3结合,从而将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位,有效减少肿瘤治疗中对正常组织细胞的损害,提高药物本身疗效[1].干扰素(interferon,IFN)是一类重要的细胞因子,具有抗病毒、抑制某些细胞生长、免疫调节、抑制和杀伤肿瘤细胞等多种作用,在临床上已被广泛用于恶性肿瘤与病毒疾病的治疗[2-3].增强型绿色
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Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性
目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法.方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中.经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定.后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性.结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白.用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性.我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97) nmol/L,与报道值一致.结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害.此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究.
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小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达
目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白.
