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人KIAA1199蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定
目的 KIAA1199是一种功能未知的胞浆蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pMAL-C2X和pGEX-5X-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199,分别表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的MBP-KIAA1199融合蛋白和含重组谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白GST-KIAA1199.其中,MBP-KIAA1199融合蛋白经纯化后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体；GST-KIAA1199融合蛋白用于检测抗体特异性.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199两个重组质粒构建成功,并获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论 成功制备了KIAA1199抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.
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维吾尔族和汉族女性乳腺癌与KIAA1199基因表达达调控的关系
目的 探讨维吾尔族和汉族女性乳腺癌与KIAA1199表达调控的关系.方法 收集维吾尔族和汉族女性乳腺纤维腺瘤、乳腺癌患者的石蜡包埋组织标本150例(维吾尔族68例,汉族82例),另选取新鲜组织标本58例(维吾尔族21例,汉族37例),采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测KIAA1199蛋白和mRNA表达水平.结果 乳腺纤维腺瘤细胞中KIAA1199蛋白表达上调率为31.9％,乳腺癌细胞中KIAA1199蛋白表达上调率为76.7％,差异有统计学意义(P＜0.01),维吾尔族、汉族女性乳腺癌KIAA1199表达上调率的变化趋势具有共性(维吾尔族x2=12.30,P＜0.01;汉族x2=15.19,P＜0.01),其族群差异无统计学意义(P＞0.05).KIAA1199基因的转录表达水平在乳腺癌组织中明显上调,其mRNA相对含量为0.967±0.281,乳腺纤维腺瘤组织中KIAA1199 mRNA含量为0.475±0.176,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 KIAA1199表达上调伴随着乳腺病变进程,可能成为乳腺癌分子预警指标.
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KIAA1199在原发性肝癌中的表达及临床意义
目的 观察KIAA1199在原发性肝癌中的表达及其临床意义.方法 收集136例原发性肝癌患者癌组织及其配对的癌旁组织,采用免疫组化、Western印迹法检测KIAA1199的蛋白表达,并分析其与临床病理特征及预后的关系.结果 原发性肝癌组织中KIAA1199阳性表达率为82.3％(112/136),高于其配对癌旁组织的阳性表达率14.7％(20/136),原发性肝癌组织中KIAA1199的高表达与患者年龄、肝硬化史、肿块大小、肿瘤数目、分化程度、TNM分期、微静脉侵犯(MVI)显著相关(P＜0.05),而与患者性别、饮酒史、肝炎史、家族遗传史、肿瘤部位无显著相关(P＞0.05).经Kaplan-Meier法分析,KIAA1199在原发性肝癌中的高表达与患者总生存率的下降显著相关(P＜0.01).此外,我们对其进行Cox比例风险模型统计分析,KIAA1199高表达与患者年龄、肝硬化史、肿块大小、肿瘤数目、分化程度、TNM分期、MVI等预后因素显著相关(P＜0.05).结论 KIAA1199在原发性肝癌组织中高表达,且与临床病理特征及预后密切相关,KIAA1199高表达显著增加了患者的死亡风险.
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靶向抑制KIAA1199基因的表达对人结肠癌细胞SW620生长的影响
目的 探讨靶向沉默KIAA1199基因的表达对人结肠癌SW620细胞生长能力的影响.方法 运用RNA干扰(shRNA)技术构建携带靶向抑制KIAA1199分子的慢病毒载体LV3-KIAA1199-shRNA并感染人结肠癌细胞株SW620为实验组(shKIAA1199),携带无义序列的对照慢病毒载体LV3-NC-shRNA为阴性对照组(shNC),未转染的细胞为空白对照组(MOCK).72 h后用荧光显微镜观察慢病毒的感染效率,RT-PCR法验证慢病毒感染后KI-AA1199 mRNA在MOCK、shNC和shKIAA1199各组细胞中的表达水平,并用嘌呤霉素筛选KIAA 1199静默和阴性对照的稳转细胞.用MTT法检测MOCK、shNC和shKIAA1199各组细胞活力,流式细胞仪分别检测三组细胞的凋亡率和细胞周期的变化.结果 携带靶向干扰KIAA1199基因的慢病毒感染人结肠癌细胞株SW620后,能有效下调KIAA1199在细胞内的表达水平并成功筛选KIAA 1199静默的SW620稳转细胞;与MOCK和shNC组比较,shKIAA1199组细胞活力减少(P＜0.05),细胞凋亡率明显升高(P＜0.05),处于细胞周期中G1期的细胞数量比例明显下降(P＜0.05),G2/M期细胞比例增加(P＜0.05).结论 下调KIAA 1199基因的表达可抑制SW620细胞的增殖,促进该细胞的凋亡,使该肿瘤细胞的生长周期受到阻滞.
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KIAA1199基因重组慢病毒载体的构建及在人胃肿瘤细胞MKN28中的表达
目的 构建KIAA1199基因过表达的重组慢病毒载体,感染人胃癌细胞MKN28并使KIAA 1199基因有效表达.方法 将慢病毒载体GV367和KIAA 1199基因序列用AgeI和NheI双酶切、连接、筛选及测序获得重组慢病毒质粒GV367-KIAA1199.将测序正确的GV367-KIAA 1199重组载体和辅助质粒Help1.0和Help2.0用Lipofectamine2000共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体LV-KIAA 1199.予荧光稀释法和药物筛选法测定重组慢病毒的感染滴度.以携带空白基因片段的慢病毒载体LV-NC为病毒对照组.将LV-KIAA 1199和LV-NC以相同的病毒感染复数(MOI)分别感染人胃癌细胞株MKN28;荧光显微镜观察EGFP在细胞中的表达;实时定量PCR检测KIAA1199的mRNA在细胞中的表达水平.结果 重组慢病毒载体LV-KIAA 1199构建成功,LV-KIAA 1199感染胃癌细胞后,荧光显微镜下可见细胞中呈现绿色荧光;KIAA1199的mRNA的表达均显著高于对照病毒组.结论 重组慢病毒载体LV-KIAA1199可携带KIAA 1199基因在人胃癌细胞株MKN28中进行有效过表达.
